植物乳杆菌的功能评价

2016-12-28王延斌

生物加工过程 2016年6期

关键词：胆盐胞外存活率

熊强，王凯，王延斌

(南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800)

植物乳杆菌的功能评价

熊强，王凯，王延斌

(南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京211800)

植物乳杆菌；胞外多糖;抗氧化

益生性乳酸菌可黏附到人体肠道上皮细胞、在黏膜表面定殖，并且能在人的胃肠道存活，调节胃肠道微生态平衡。它在人体中起着积极的作用，有降低胆固醇、抗氧化、提高免疫力、优化肠道微环境等生物学功能[1]。Liu等[2]研究发现，L.paracaseispp.paracaseiNTU 101和102 合成的多糖EPSs，对DPPH自由基(·DPPH)的清除能力与阳性对照品Vc相接近，且均表现出温和的脂质过氧化抑制作用和Fe2+螯合能力。乳酸菌产生胆盐水解酶，催化胃肠道中结合态胆盐水解为氨基酸残基和游离的胆酸[3]，从而降低血清胆固醇。益生菌还可以通过同化吸收或细胞表面结合的方式降低胆固醇[4]。目前，国内对优良的益生性乳酸菌发酵剂的研发尚缺乏，因此乳酸菌益生性的研究有待深入，这将有助于提升乳酸菌发酵产品的品质，从而促进我国食品发酵行业的发展。

本文中，笔者对实验室筛选得到的乳酸菌株进行耐酸、耐胆盐和耐人工肠胃液试验，考察乳酸菌的环境耐受性；结合乳酸菌降胆固醇及其胞外多糖抗氧化试验，考察乳酸菌的益生性。最终筛选出具有环境耐受性的优良益生性乳酸菌，为乳酸菌发酵剂的开发提供优良菌种。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 培养基

基础培养基(PYG)[5](1 L)：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，胰酶解酪朊5 g，酵母提取物10 g，盐溶液40 mL，琼脂20 g，溴甲基酚紫0.04 g；pH 6.8。

乳酸细菌液体培养基(MRS)[5](1 L)：胰蛋白胨5 g，酵母浸出粉5 g，柠檬酸铁铵2 g，乙酸钠5 g，Na2HPO42 g，MnSO4·H2O 0.05 g,MgSO4·7H2O 0.5 g，葡萄糖15 g，乳糖5 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g,吐温-80 1 mL；pH 6.7。

乳酸细菌降胆固醇培养基(MRS-CHOL-THIO)[6]：MRS液体培养基中加入已过滤除菌的质量分数0.20%的巯基乙酸钠、3 g/L胆盐和100 μg/mL胆固醇，加热溶解。

以上培养基在121 ℃条件下灭菌15 min。

1.1.2 主要仪器设备

752s型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；SW-CJ-1FD型超净台，苏州安泰空气技术公司；KH3200型超声波破碎仪，昆山禾创超声仪器有限公司；GL-21M型立式高速冷冻离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；氮吹仪，上海济成分析仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 植物乳杆菌的分离鉴定

从实验室自制泡菜中，按照初筛、复筛步骤分离纯化乳酸菌[5]。利用过氧化氢酶试验、H2S试验、糖发酵试验等生理生化试验及16S rDNA分子鉴定方法[5]，对分离得到的菌株进行鉴定。

1.2.2 环境耐受性试验

1)耐酸性试验

利用乳酸细菌培养基(MRS)，在37 ℃下活化两代。取2 mL活化好的菌液，分别接种至pH 3.0和pH 6.4的100 mL液体MRS培养基中，37 ℃下培养3 h后取样进行平板菌落计数。

2)耐胆盐试验

将活化好的菌株以2%接种量(体积分数)接至含30 g/L牛胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃培养8 h。分别取0和8 h时的菌液进行平板菌落计数。

3)人工胃液和人工肠液耐受性试验

以2%接种量将活化好的菌株接种至无菌的pH 3.0的人工胃液[6]中，37 ℃培养，3 h后取样进行平板菌落计数。然后，取人工胃液中培养3 h后的菌液，以2%接种量接种至无菌的pH 8.0的人工肠液[6]中，37 ℃培养8 h后测定活菌数。

4)评价指标

以存活率作为环境耐受性试验的评价指标，存活率计算见式(1)。

(1)

式中：N0、Nt分别为在上述试验条件下，0 h和th后测得的活菌数。

1.2.3 体外降胆固醇能力的测定

植物乳杆菌降胆固醇能力的测定参照文献[6]的方法，胆固醇标准曲线见图1。

图1 胆固醇标准曲线Fig.1 The standard curve of cholesterol

1.2.4 植物乳杆菌胞外多糖的抗氧化能力测定

1)植物乳杆菌胞外多糖的分离纯化

粗多糖分离后[7]，采用DEAE-Sepharose Fast Flow 离子柱和Sepharose CL-6B凝胶柱分步纯化，测定收集管中多糖，合并收集峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥得到多糖样品。

2)植物乳杆菌胞外多糖结构的初步鉴定

通过紫外分光光度法测蛋白核酸吸收[8]，傅立叶红外光谱仪(FT-IR)分析多糖的结构[9]，凝胶层析分析多糖的相对分子质量，HPLC分析多糖的单糖组成[10]。

3)·DPPH清除能力的测定

参照文献[11]的方法测定植物乳杆菌胞外多糖对·DPPH清除能力。

(2)

式中：A0为等体积甲醇代替·DPPH溶液的吸光值，作空白；An是等体积蒸馏水代替样品溶液后的吸光值，为对照组；Am为样品溶液与·DPPH甲醇溶液在室温下避光反应0.5 h后，517 nm处测的吸光值。

4)羟基自由基清除能力的测定

参照文献[12]的方法测定植物乳杆菌胞外多糖对羟基自由基清除能力。

(3)

注：Ah为用1 mL蒸馏水代替1 mL H2O2后测得的吸光值；Ae为用样品代替1 mL蒸馏水后的结果；Ay为邻二氮菲溶液，FeSO4溶液和H2O2溶液，在37 ℃的水浴中，反应1.5 h后，在536 nm处测得的吸光度。

5)超氧阴离子自由基清除能力的测定

(4)

式中:A为在3 mL Tris-HCl缓冲液中加入适量样品，测样品的邻苯三酚自氧化速率，Ao为对照值。

1.2.5 数据分析

文中数据为3次平行测定值的平均值，数据以X±SD表示。显著性分析采用 SPSS 20.0(SPSS 公司)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA，Student-Newman-Keuls)。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌鉴定结果

筛选得到的6株菌，它们都是革兰氏阳性菌(G+)、无芽孢杆菌，接触酶阴性、不产生H2S，结合糖发酵试验的结果初步鉴定为乳杆菌属[1]。对菌株Z22进行16S rDNA分析及系统发育树的建立，结果见图2和3。由图3可知，菌株Z22与植物乳杆菌相似度为99%。

M—GeneRuler 1 kb DNA Ladder;1—菌株Z22的16S rDNA PCR结果图2 菌株Z22的16S rDNA基因扩增电泳Fig.2 Electrophoresis of PCR-amplified16S rDNA from Z22

2.2 耐酸及耐胃液试验结果

当进食时，通常人胃部的pH维持在3.0左右[13],食物在胃中停留时间较短，一般为1～3 h[14]。因此，选择在pH 3.0的条件下，检测供试菌株在酸性培养基和人工胃液培养3 h后的存活率，结果见图4。

图3 基于16S rDNA建立的乳杆菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Lactobacillus based on 16S rDNA gene sequence

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)图4 6株植物乳杆菌分别在pH3.0和人工胃液的条件下培养3 h后的存活率Fig.4 The survival rates of six strains L.plantarum in pH 3.0 and simulated gastric fluidafter three hours

由图4可知：6株植物乳杆菌在pH 3.0的条件下，培养3 h后，均有很高的存活率，表现出很好的耐酸性。其中，Z12存活率最高，达到98.08%；Z22次之，为96.75%；6株植物乳杆菌在人工胃液中培养3 h后，同样有较高的存活率，Z22最高，为95.45%；Z31次之，为90.42%，说明这几株菌都有较好的耐胃蛋白酶和耐酸的能力。

2.3 耐胆盐及耐肠液试验结果

食物在小肠中停留的时间为3～8 h[14]，小肠内胆酸盐浓度通常低于4 g/L[15],一般维持在3 g/L。因此测定3 g/L胆盐的条件下，8 h后供试菌株的存活率，结果见图5。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)图5 6株植物乳杆菌分别在3 g/L胆盐和人工肠液的条件下培养8 h后的存活率Fig.5 The survival of six strains L.plantarum in thecondition of 3 g/L bile salt and simulatedintestinal fluid

由图5可知：所有的供试菌株在3 g/L胆盐条件下维持8 h后，仍然保持较高的存活率，Z22存活率最高为76.59%；Z12次之，为72.63%。胃液培养4 h后的菌株在人工肠液中继续培养8 h后，存活率明显下降，Z22存活率最高，仅为45.24%；F21次之，为43.35%。这些结果表明植物乳杆菌对胆盐比较敏感，Hamon等[16]对LC56 的研究和Karasu等[17]关于LP3 的试验也说明了这一点。同时，胃液环境对植物乳杆菌生长不利，从而导致了6株菌在肠液中的存活率显著下降。尽管如此，Z22还是表现出了较好的耐胆盐和耐肠液的能力。

2.4 降胆固醇试验结果

考察6株菌的降胆固醇试验，结果如图6所示。由图6可知：6株供试菌株均有较好的胆固醇脱除能力，胆固醇脱除率均超过了40%，其中，Z22对胆固醇脱除率最高，达到65.80%；Z31次之，脱除率为55.95%。由于胆固醇的脱除率会随着胆酸盐浓度提高而增加[18-19]，同时也与培养基中添加的胆固醇质量浓度成正比[20]，因此在不同的条件下，试验结果也会不同。但总体而言，菌株Z22和Z31还是表现出较好的胆固醇去除能力。

不同字母表示差异极显著(P<0.01)图6 6株植物乳杆菌胆固醇脱除率Fig.6 The cholesterol removal of six strains L. plantarum

2.5 植物乳杆菌胞外多糖结构的初步表征

综上可以发现，植物乳杆菌Z22表现出较好的性能，因此,选择菌株Z22进行胞外多糖的分离纯化。通过粗提取和层析柱分离纯化，得到不带电荷的中性多糖EPS-Z(平均相对分子质量为2.42×105)和带负电荷的酸性多糖EPS-S(平均相对分子质量为3.20×105)。利用色谱法研究两种多糖的单糖组成，结果见图7和图8。

图7 6种单糖标准品的PMP衍生物的液相色谱Fig.7 HPLC chromatogram of PMP derivatives of the six kinds of monosaccharides

图8 EPS-Z(a)和EPS-S(b)的液相色谱Fig.8 HPLC chromatogram of EPS-Z(a)and EPS-S(b)

由图7和图8可知，EPS-Z含Man和Glc，其质量比为3.22∶ 1.00，没有检测到糖醛酸的存在；EPS-S由Man、Glc、Rham、Gal和Xyl组成，其质量比为8.57∶ 6.10∶ 2.42∶ 1.29∶ 1.00，其含GlcUA占单糖总和的7.29%，这正是酸性多糖带负电荷的原因。

利用紫外分析这两种胞外多糖，结果见图9。由图9可知：EPS-S和EPS-Z在260～280 nm之间没有吸收峰，表明多糖组成中不含核酸和蛋白。

图9 EPS-Z和EPS-S紫外分析谱Fig.9 UV analysis spectra of EPS-Z and EPS-S

利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)来分析这两种多糖，结果见图10。由图10可以发现：EPS-Z和EPS-S均为β-型吡喃糖，具有多糖特征吸收峰，具有—OH、—O—、—COO—等官能团。

图10 植物乳杆菌Z22胞外多糖 EPS-Z和EPS-S红外光谱图Fig.10 FT-IR spectra of the extracellular polysaccharideEPS-Z and EPS-S from L. plantarum Z22

2.6 植物乳杆菌多糖胞外抗氧化能力的测定

分别考察植物乳杆菌Z22 EPS-Z和EPS-S对·DPPH、·OH、·O2-基的清除能力，结果见图11～13。

图11 植物乳杆菌Z22胞外多糖对·DPPH的清除能力Fig.11 Scavenging activity of extracellular polysaccharideL. plantarum Z22 on DPPH radical

由图11可知：以Vc做阳性对照，植物乳杆菌Z22的胞外酸性多糖EPS-S和中性多糖EPS-Z对·DPPH的清除能力随着多糖浓度的增加而增强，在1 mg/mL时，分别达到27.75%和24.02%。酸性多糖EPS-S的清除效果总体要优于EPS-Z，可能是酸性多糖含有糖醛酸，提升了其对·DPPH的清除能力。在多糖中含有的糖醛酸，为其提供大量的负电荷，这些带负电荷的多糖分子，由于内部的排斥使其结构更加伸展，从而降低了自由基攻击分子时的空间位阻[21]，加速自由基的猝灭反应，从而提升多糖的抗氧化活性。

图12 植物乳杆菌Z22胞外多糖对·OH清除能力Fig.12 Scavenging activity of extracellular polysaccharide of L.plantarum Z22 on hydroxyl radical

图13 植物乳杆菌Z22胞外多糖对清除能力Fig.13 Scavenging activity of extracellular polysaccharideL. plantarum Z22 on superoxide radical

2.7 功能性评价分析

表1 植物乳杆菌功能性评价结果Table 1 Results of gastrointestinal survival and benificial properties of L.plantarum

注：“—”表示文献中无记录；E～K分别代表L.plantarumZ22、L.plantarumEM[24]、L.plantarumS4-1[25]、L.plantarumNDC 7501[2]、L.plantarumC88[26]、L.plantarum70810[27]和L.plantarumYW32[28]。

3 结论

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(责任编辑荀志金)

Gastrointestinal survival and beneficial properties in vitro of Lactobacillus plantarum strains

XIONG Qiang,WANG Kai,WANG Yanbin

(College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)