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(1.广东省第二人民医院呼吸内科，广东 广州 510317；2.广东省第二人民医院心胸外科)

·基础医学·

AEG-1抑制miR-137对非小细胞肺癌增殖调控作用

常永梅1*，王明智2，孙聪1，颜文森1，刘庆峰1，江小运1，王钧1

(1.广东省第二人民医院呼吸内科，广东 广州 510317；2.广东省第二人民医院心胸外科)

目的探讨AEG-1在miR-137抑制非小细胞肺癌(NSCLC)增殖中的作用及机制。方法收集2013年2月～2014年5月在本院手术治疗的65例NSCLC患者肿瘤标本，提取RNA，qRT-PCR检测NSCLC组织、A549、H460及16HBE细胞中miR-137与AEG-1的表达，统计分析NSCLC组织中miR-137与胶质细胞上调基因1(AEG-1)表达的相关性；将A549细胞根据不同转染试剂分成4组：转染miR-137 mimics及空载体组，转染miR-137 mimics及AEG-1表达载体组，转染miR-137 inhibitor及siRNA无关序列组，转染miR-137 inhibitor及AEG-1 siRNA组。用Lipofectamine 2000进行转染，生长曲线实验检测转染后细胞增殖情况。结果在NSCLC组织中miR-137与AEG-1的表达呈负相关；miR-137表达高的NSCLC细胞中AEG-1表达降低；共同转染miR-137 mimics与AEG-1过表达载体的A549细胞在48 h的细胞数高于对照组，而共同转染miR-137 inhibitor与AEG-1 siRNA的A549细胞在48 h、72 h的细胞数低于对照组。结论miR-137与AEG-1在NSCLC组织及细胞中表达呈负相关；AEG-1逆转miR-137对NSCLC细胞增殖的作用。

miR-137；非小细胞肺癌；胶质细胞上调基因1；增殖

肺癌是全球引起死亡最高的恶性肿瘤。大约70%～80%的肺癌是非小细胞肺癌(non samll cell lung cancer，NSCLC)，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌[1]。非小细胞肺癌的预后很差，尽管今年化疗药物研究进展及治疗手段的进步，NSCLC的5年总体生存率仍不超过11%。NSCLC的主要死亡原因是化疗耐药性和转移，但是NSCLC转移的机制仍不十分清楚[2]。

微小RNA是小的非编码RNA，其在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。miRNAs与靶基因的3’非翻译区(3’ untranslation regions，3’-UTRs)结合，引起靶基因mRNA降解或抑制翻译[3]。越来越多的证据表明miRNAs在NSCLC的转移过程中发挥重要作用。许多miRNA在NSCLC中发挥抑瘤作用，抑制转移，如：miR-200c[4]、miR-26b[5]，而另一些miRNA发挥促进NSCLC转移的功能，如：miR-1260b[6]。miR-137通过靶向SLC22A18、Cdc42、Cdk6抑制NSCLC增殖[7]，也可通过靶向BMP7抑制NSCLC细胞侵袭转移[8]。有研究表明，miR-137通过靶向胶质细胞上调基因(Astrocyte elevated gene 1，AEG-1)抑制卵巢癌细胞生长[9]。而NSCLC中，miR-137与AEG-1的表达调控关系尚无报道。本研究拟通过研究miR-137在NSCLC中对AEG-1表达调控的作用，探讨miR-137抑制NSCLC侵袭转移的机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养NSCLC细胞株A549、H460及正常的肺支气管上皮细胞系16HBE从ATCC购买。细胞培养基：DMEM，10%胎牛血清，2 μmol/L谷氨酰胺，100 IU/mL 青霉素及100 μg/mL 硫酸链霉素，在37 ℃ 5%二氧化碳环境中培养。

1.2临床标本收集及资料人非小细胞肺癌取自广东省第二人民医院2013年2月～2014年5月手术治疗的65例患者，这些患者中无人接受手术前化疗。记录患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移等资料。本研究经广东省第二医学伦理委员会批准。

1.3试剂AEG-1过表达载体购自武汉三鹰公司。AEG-1 siRNA购自Qiagen公司。转染试剂为Lipofectamine 2000(Life)。

1.4总RNA提取、逆转录用Trizol(Life)提取RNA。用Nanodrop 2000(Thermo)测定RNA浓度及纯度。用cDNA合成试剂盒及miRNA特异性检测试剂盒(Genecopeoia)。cDNA合成的条件为：50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.5细胞转染将NSCLC A549细胞接种于6孔板，分成4组：转染miR-137 mimics及空载体组，转染miR-137 mimics及AEG-1表达载体组，转染miR-137 inhibitor及siRNA无关序列组，转染miR-137 inhibitor及AEG-1 siRNA组。用Lipofectamine 2000进行转染，根据转染试剂说明书进行操作。转染48 h后提取RNA及蛋白。

1.6生长曲线将A549细胞接种至24孔板，5 000/孔。细胞贴壁后，分成4组(同1.5分组及名称)进行处理于转染24 h、48 h、72 h行细胞计数，绘制生长曲线。

1.7荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 以2-ΔΔCT表示基因或miRNA表达，ΔΔCT = (CTmiRNA-CTU6)癌- (CTmiRNA-CTU6)癌旁。AEG-1的表达以GAPDH为内参，使用以下引物:F:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC,R:GAAGATGGTGATGGGATTTC。ΔΔCT= (CTAEG-1-CTGAPDH)癌-(CTAEG-1-CTGAPDH)癌旁，仪器为Light Cycler 480 II(Roche Diagnostics;Indianapolis,IN)。

1.8统计学方法采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，相关性分析用Pearson检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 miR-137与AEG-1在NSCLC组织及细胞中表达呈负相关qRT-PCR检测了NSCLC组织及细胞中miR-137与AEG-1的表达。相关性分析显示在NSCLC组织中miR-137与AEG-1的表达呈负相关(r=-0.5285，P<0.001)(图1)。miR-137在NSCLC细胞中的表达显著低于肺支气管上皮细胞16HBE(P<0.05)，而NSCLC中AEG-1的表达明显高于16HBE(P<0.01)，miR-137及AEG-1在NSCLC及16HBE细胞中的表达相反(图2)。

2.2 AEG-1逆转miR-137对NSCLC细胞增殖的作用在转染miR-137 mimics的A549细胞中同时转染AEG-1过表达载体，细胞48 h细胞数高于对照组(P<0.05)；在转染miR-137 inhibitor的A549细胞中同时转染AEG-1 siRNA，细胞48 h及72 h的细胞数低于对照组(P<0.05。见图3。

图1 NSCLC组织中miR-137与AEG-1表达相关性分析

图2 miR-137及AEG-1在NSCLC细胞及肺支气管上皮细胞中的表达 与16 HBE比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

研究证实，miRNAs 在NSCLC发生发展过程中发挥重要作用[10]。miRNAs作为肿瘤抑制或致癌基因参与肿瘤发展的多个过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭[11]。miR-137在多种肿瘤中发挥抑瘤作用。最新的研究表明，miR-137可通过靶向表皮生长因子受体抑制甲状腺癌的增殖[12]。在肺癌中，miR-137可抑制肺癌的增殖并促进肺癌的紫杉醇和顺铂的药物敏感性[13]， 还能通过靶向骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 7，BMP7)抑制NSCLC细胞迁移和增殖[8]，也可通过抑制KIT的表达抑制小细胞肺癌细胞增殖[14]。

AEG-1已被确认为是在许多恶性肿瘤进展和转移过程中的一个重要的致癌基因，它可调控Ras、PI3K / Akt、NF-κB、ERK和Aurora-A激酶等多个信号通路。AEG-1在肺癌中表达增加，促进NSCLC迁移[15]，可通过活化Wnt/β-catenin信号通路诱导肺癌细胞发生上皮间质样变[16]。针对AEG-1的治疗手段应具有抑制转移、肿瘤生长、提高化疗敏感性等特性。研究表明，AEG-1在肿瘤中的表达受多个miRNA调控，其中包括miR-137[9]。但miR-137与AEG-1在肺癌中的表达尚无研究。因此，本研究通过qRT-PCR的方法检测了65例NSCLC组织中miR-137及AEG-1 mRNA的表达，并且证实两者在NSCLC组织中表达呈反比。这与已报道的两者在卵巢癌中的表达变化相似。已知，miR-137为抑癌miRNA，在肺癌可抑制细胞增殖，而AEG-1在肺癌中表达增加，并且参与促进NSCLC细胞增殖[17]。作为miR-137的靶基因，AEG-1是否参与了miR-137对NSCLC细胞功能的调控？于是，本研究检测了miR-137与AEG-1共同对NSCLC细胞增殖的影响。结果证实，miR-137与AEG-1共同高表达组细胞增殖率明显高于miR-137高表达组，miR-137与AEG-1共同表达抑制组细胞增殖率低于miR-137高表达组。这说明AEG-1作为miR-137的靶基因逆转了miR-137抑制NSCLC细胞增殖的作用。

图3 miR-137与AEG-1对NSCLC细胞增殖的影响 A：miR-137 mimics及AEG-1对A549细胞增殖的影响；B：miR-137 inhibitor及AEG-1 siRNA对A549细胞增殖的影响。Scramble：无关序列；NC：inhibitor的对照序列； *P<0.05

本研究证实了NSCLC组织及细胞中miR-137与AEG-1表达呈负相关，并且AEG-1可逆转miR-137对NSCLC细胞增殖抑制作用。但是AEG-1的这种作用调控的下游信号通路尚不清楚，这成为我们后续研究的方向。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61:69-90.

[2] Gao D,Vahdat LT,Wong S,et al.Microenvironmental regulation of epithelial-mesenchymal transitions in cancer[J].Cancer Res,2012,72:4883-4889.

[3] Chou J,Shahi P,Werb Z.microRNA-mediated regulation of the tumor microenvironment[J].Cell Cycle,2013,12:3262-3271.

[4] Jiao A,Sui M,Zhang L,et al.MicroRNA-200c inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer cells by targeting ZEB2,an epithelial-mesenchymal transition regulator[J].Mol Med Rep,2016,13(4):3349-3355.

[5] Li D,Wei Y,Wang D,et al.MicroRNA-26b suppresses the metastasis of non-small cell lung cancer by targeting MIEN1 via NF-κB/MMP-9/VEGF pathways[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,472(3):465-470.

[6] Xu L,Li L,Li J,et al.Overexpression of miR-1260b in non-small cell lung cancer is associated with Lymph Node Metastasis[J].Aging Dis,2015,6(6):478-485.

[7] Zhang B,Liu T,Wu T,et al.microRNA-137 functions as a tumor suppressor in human non-small cell lung cancer by targeting SLC22A18[J].Int J Biol Macromol,2015,74:111-118.

[8] Yang YR,Li YX,Gao XY,et al.MicroRNA-137 inhibits cell migration and invasion by targeting bone morphogenetic protein-7 (BMP7) in non-small cell lung cancer cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):10847-10853.

[9] Guo J,Xia B,Meng F,et al.miR-137 suppresses cell growth in ovarian cancer by targeting AEG-1[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,441(2):357-363.

[10] Du L,Pertsemlidis A.microRNA regulation of cell viability and drug sensitivity in lung cancer[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12:1221-1239.

[11] Angulo M,Lecuona E,Sznajder JI.Role of MicroRNAs in lung disease[J].Arch Bronconeumol,2012,48:325-330.

[12] Dong S,Jin M,Li Y,et al.miR-137 acts as a tumor suppressor in papillary thyroid carcinoma by targeting CXCL12[J].Oncol Rep,2016,35(4):2151-2158.

[13] Yang YR,Li YX,Gao XY,et al.MicroRNA-137 inhibits cell migration and invasion by targeting bone morphogenetic protein-7 (BMP7) in non-small cell lung cancer cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):10847-10853.

[14] Li P,Ma L,Zhang Y,et al.MicroRNA-137 down-regulates KIT and inhibits small cell lung cancer cell proliferation[J].Biomed Pharmacother,2014,68(1):7-12.

[15] Zhu R,Tian Y.Astrocyte elevated gene-1 increases invasiveness of NSCLC through up-regulating MMP7[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(3):1187-1195.

[16] He W,He S,Wang Z,et al.Astrocyte elevated gene-1(AEG-1) induces epithelial-mesenchymal transition in lung cancer through activating Wnt/β-catenin signaling[J].BMC Cancer,2015,15:107.

[17] Meng F,Zhang L,Shao Y,et al.microRNA-377 inhibits non-small-cell lung cancer through targeting AEG-1[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):13853-13863.

AEG-1ReversestheInhibitionofNon-smallCellLungCancerProliferationInducedbyMiR-137

CHANG Yongmei,WANG Mingzhi,SUN Cong,et al

(DepartmentofRespiratoryMedicine,GuangdongNo.2ProvincialPeopleHospital，Guangzhou,Guangdong510317,China)

ObjectiveTo investigate the the function of AEG-1 (astrocyte elevated ) in the process of miR-137 inhibiting the proliferation of non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsSixty five samples in our hospital from Feb.2013 to May 2014 were collected.And RNA was extracted from these samples.QRT-PCR was conducted to detect the expression of miR-137 and AEG-1 in NSCLC tissues,and A549,H460 and 16HBE cells.The correlation between miR-137 and AEG-1 in NSCLC tissues was statistically analyzed.A549 cells were divided into four groups according to the transfection treatment:miR-137 mimics plus empty vector group,miR-137 mimics plus AEG-1 expression vector group,miR-137 inhibitor plus scramble sequence group,and miR-137 inhibitor plus AEG-1 siRNA group.The growth curve assay was performed to detect the cells proliferation after transfection treatment.ResultThe expression of miR-137 is negatively correlated with the AEG-1 in NSCLC tissues.The expression of AEG-1 was decreased in miR-137 overexpressed NSCLC cells.The cell number of A549 co-transfected with miR-137 mimics and AEG-1 expression vector was larger than the control group in 48 h.And,the cell number of A549 co-transfected with miR-137 inhibitor and AEG-1 siRNA was smaller than the control group in 48 h and 72 h.ConclusionThe expression of miR-137 is negatively correlated with the expression of AEG-1 in NSCLC tissues and cells;AEG-1 reversed the effect of miR-137 in the proliferation of NSCLC cell.

miR-137; non-small cell lung cancer; AEG-1; proliferation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.010

2016-01-28；

2016-04-28

广东省科技计划项目(2014A020212447).

*通讯作者，E-mail:cym891@163.com.

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蒋湘莲)