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(1.南华大学附属第一医院放疗科，湖南 衡阳 421001；2.中山大学肿瘤防治中心；3.南华大学医学院肿瘤研究所)

·基础医学·

肿瘤微环境中不同部位CD68+巨噬细胞对鼻咽癌进展和预后的影响

蔡曼波1，邵建永2，曾益新2，左建宏3*

(1.南华大学附属第一医院放疗科，湖南 衡阳 421001；2.中山大学肿瘤防治中心；3.南华大学医学院肿瘤研究所)

目的研究免疫微环境对不同部位巨噬细胞对鼻咽癌(NPC)进展和预后的影响。方法收集在中山大学肿瘤防治中心经病理证实为鼻咽癌的石蜡标本557例。采用免疫组化染色法检测巨噬细胞分子标志物CD68，观察并计数CD68在癌巢和间质不同部位的表达，统计分析其阳性细胞数与临床病理特征及鼻咽癌患者预后的关系。结果CD68+巨噬细胞在间质中浸润比癌巢中活跃(中位数：4.47/HPF相比1.87/HPF)。Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计分析结果表明，癌巢中的CD68+巨噬细胞数量与NPC患者的无瘤生存时间及总体生存时间均显著正相关。间质中的CD68+巨噬细胞数量与NPC患者的无瘤生存时间及总体生存时间亦显著正相关。单因素Cox比例风险模型显示，癌巢中的CD68+巨噬细胞浸润较多的患者相比于数量较少的患者发生治疗后转移复发(HR=0.667，P=0.002)及死亡(HR=0.626，P=0.002)的风险较低。间质中的CD68+巨噬细胞数量较多的患者较数量较少的患者发生治疗后转移复发(HR=0.664，P=0.005)及死亡(HR=0.66，P=0.008)的风险较低。结论免疫微环境中癌巢和间质中CD68+巨噬细胞浸润数量增多与鼻咽癌患者预后呈正相关，CD68+巨噬细胞浸润数量增多可降低局部复发和远处转移风险。

肿瘤微环境； 鼻咽癌； CD68； 巨噬细胞

肿瘤微环境在肿瘤的生长和进展中发挥非常重要的作用[1-2]。由癌细胞和肿瘤间质(免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等)共同组成的组织微环境是肿瘤发生发展的主要战场，其中免疫细胞是肿瘤间质的重要微环境组分[3]。肿瘤微环境的免疫系统如何影响肿瘤的发生发展一直是肿瘤免疫学领域的一个具有挑战性难题。肿瘤相关巨噬细胞是外周血单核细胞浸润到实体肿瘤组织中而演变成的巨噬细胞,在肿瘤的基质细胞中占很大的比例。本研究采用免疫组化染色法检测巨噬细胞分子标志物CD68，观察并计数CD68+巨噬细胞在癌巢和间质不同部位的表达数目与临床病理特征及与鼻咽癌患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1临床样本选取2001年1月～2003年12月经中山大学肿瘤防治中心病理科诊断为鼻咽癌并有相应临床随访资料的组织标本557例。入选条件：(1)所收集蜡块均为患者首次就诊诊断为鼻咽癌的活检标本。(2)观察HE切片，选择癌巢较大的鼻咽癌石蜡标本。(3)标本齐全，有完整临床随访资料。(4)死于其它疾病(非鼻咽癌)或意外死亡的病人被剔除。557例病人中，包括418个男性和139个女性病人，年龄19～78岁(年龄中位数为46岁)。病人的临床分期依据1992年中国鼻咽癌分期系统进行，Ⅰ～Ⅱ期病人148个，Ⅲ～Ⅳ期病人409个。依据WHO分型将病人分为分化型非角化性癌(WHO Ⅱ型)和未分化型非角化性癌(WHO Ⅲ型)，557例病人中，139例是WHO Ⅱ型病人，402例是WHO Ⅲ型病人。随访时间2～114个月，在随访过程中死亡的235例，113例病人发生转移。

1.2免疫组化方法分子标记物CD68用免疫组化SP法检测。将组织芯片置入56 ℃恒温箱，烘片30～60 min，将切片取出后，常规脱蜡、脱水；3% H202消除内源性过氧化物酶的活性；抗原修复后，1∶500一抗孵育，4 ℃冰箱过夜；PBS冲洗后，滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗后，滴加足以覆盖整张组织切片的DAB显色溶液，显微镜下控制染色深度；自来水终止显色，盐酸酒精分化，苏木素复染，晾干或吹干后中性树胶封片。

1.3免疫组织化学结果判断免疫组化结果判定采用双盲法，由3名对病例资料完全不知情的病理医生对结果进行判定，CD68+巨噬细胞的在肿瘤癌巢和简直中的计数均在400倍高倍显微镜下随机观察5个不重复且具代表性的视野，计数每个视野下阳性细胞个数，取其平均值即为各巨噬细胞的密度。

1.4统计分析应用SPSS 16.0软件包进行统计学处理。计数资料的检验采用χ2检验，相关性分析采用Pearson法，Kaplan-Meier法比较生存情况(log-rank检验)，Cox比例风险模型进行预后的多因素分析，并计算风险比(hazard ratio，HR)和95%置信区间(confidence interval，CI)，最终得到可以独立预测预后的参数。所有统计分析均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD68+巨噬细胞在NPC微环境癌巢和间质中的表达情况NPC组织中浸润了大量巨噬细胞，本文分析了CD68+巨噬细胞在鼻咽癌癌巢(t表示)和间质(s表示)中的表达。在鼻咽癌组织中，CD68表达于巨噬细胞胞膜。研究发现，CD68+巨噬细胞(黑色箭头表示)在间质中浸润比癌巢中活跃(中位数：4.47/HPF相比1.87/HPF)。见图1。

2.2 CD68+巨噬细胞在癌巢和间质中的数量与鼻咽癌患者预后的影响本文结合患者的临床随访资料，进一步分析这些免疫细胞是否会影响患者的预后。以ROC曲线建立的cut off值为临界值，将巨噬细胞的数量分为高/低表达数量组。Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计分析结果表明，癌巢中的CD68+巨噬细胞数量与NPC患者的无瘤生存时间(P=0.004)及总体生存时间(P=0.002)均显著正相关。间质中的CD68+巨噬细胞数量与NPC患者的无瘤生存时间(P=0.005)及总体生存时间(P=0.007)亦显著正相关。

图1 CD68+巨噬细胞在鼻咽癌癌巢和间质中的表达 用免疫组化方法在鼻咽癌芯片组织石蜡切片上进行CD68免疫组化染色。t:癌巢；s:肿瘤间质

2.3 CD68+巨噬细胞在癌巢和间质中的数量对鼻咽癌患者进展的影响采用单因素Cox比例风险模型评价CD68巨噬细胞对患者治疗后转移复发及死亡的风险比(表1)。癌巢中的CD68+巨噬细胞浸润较多的患者相比于数量较少的患者发生治疗后转移复发(HR，0.667；P=0.002)及死亡(HR，0.626；P=0.002)的风险较低。间质中的CD68+巨噬细胞数量较多的患者较数量较少的患者发生治疗后转移复发(HR，0.664；P=0.005)及死亡(HR，0.66；P=0.008)的风险较低。

图2 癌巢和间质组织中CD68+巨噬细胞与患者的Kaplan-Meier累计生存曲线 A:无瘤生存曲线；B:总体生存曲线. 黑线，巨噬细胞较少；灰线，巨噬细胞较多

表1总生存和无瘤生存的单因素Cox比例风险模型

PatientsOS%95%CIHRP值DFS%95%CIHRP值CD68t低27962.4054.8高27775.100.462～0.8480.6260.00267.90.506～0.8790.6670.002CD68s低16960.4052.7高38772.400.486～0.8950.660.00864.90.502～0.8800.6640.005

2.4癌巢和间质中巨噬细胞与各项临床参数之间的相关性肿瘤微环境中的CD68+巨噬细胞能显著影响患者的预后，浸润数量增多能明显降低患者治疗后转移复发及死亡风险。进一步分析癌巢和间质中巨噬细胞和调节性T细胞与各项临床参数之间的相关性。结果如表2所示，CD68+巨噬细胞在NPC癌巢中的数量与肿瘤转移复发明显负相关(Pearson’s R=-0.134P=0.002)。而间质中的CD68+巨噬细胞数量亦与与肿瘤转移复发显著负相关(Pearson’s R=-0.118P=0.006)。由此可见，NPC局部组织浸润的CD68+巨噬细胞能有效的发挥抗肿瘤的免疫效应，是预后良好的指标。

表2CD68+巨噬细胞癌巢和间质中的细胞数量与临床病理参数的相关性

CD68s低(n=170)高(n=387)P值CD68t低(n=279)高(n=278)P值年龄(年)0.0720.031 <4676205128153 >=4694182151125性别0.9280.941 男128290209209 女42977069肿瘤分级0.5810.973 T1+T263153108108 T3+T4107234171170淋巴结状态0.610.681 N047997175 N1-3123288208203复发或转移0.0060.002 Yes8013512689 No89252153188TNM临床分期0.550.517 Ⅰ+Ⅱ421057770 Ⅲ+Ⅳ128282202208组织学类型0.780.027 NKUC121281193209 NKDC44957366

TNM:肿瘤淋巴结转移；CD68t:癌巢CD68;CD68s:肿瘤间质CD68

3 讨 论

早在1889年，Stephen Paget就提出了肿瘤的“种子土壤”学说，他认为肿瘤是“癌细胞”(种子)在适宜的“肿瘤间质”(土壤)中长期进化的结果[1]。由癌细胞和肿瘤间质(免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等)共同组成的组织微环境是肿瘤发生发展的主要战场，其中免疫细胞是肿瘤间质的重要微环境组分。免疫微环境作为肿瘤微环境有机整体的重要组成部分被视为肿瘤的“第七大标记性特征”，其所起作用越发受到重视[4]。新近研究发现，免疫微环境可直接或间接地影响肿瘤的发生发展。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是近年来肿瘤免疫微环境研究的热点,在肿瘤组织中广泛存在,是构成肿瘤基质细胞最主要的成分,其显著的免疫组化标记物是CD68。单核/巨噬细胞作为机体固有免疫的重要组成细胞，同时又是一类主要的抗原呈递细胞(APC)，在诱导和调节特异性抗肿瘤免疫应答的过程中起着关键的作用。现在的研究发现，巨噬细胞与肿瘤的发生发展密切相关，可促进肿瘤进展，如能够刺激肿瘤血管生成和增强肿瘤细胞迁移、侵袭和转移[2]。肿瘤相关巨噬细胞在缺氧的情况下，可通过分泌如VEGF、IL-8和 PGE2等不同血管活性因子以及MMP9等蛋白酶诱导肿瘤血管生成。也有研究发现肿瘤微环境中的巨噬细胞也可以与肿瘤细胞相互作用，通过破坏细胞外间质和促进肿瘤细胞运动，诱导肿瘤细胞侵袭而进入血管[5-8]。而且在很多实体瘤相关报道中，TAM的细胞数目与患者的预后呈负相关，例如卵巢癌和肝癌等[9-10]。而在肠癌、胃癌、淋巴瘤和肺癌和黑色素瘤的研究中得出相反的结果。巨噬细胞可分泌免疫调节因子( 如:干扰素,白介素和TNF-α) 和酶,并将肿瘤抗原呈递给细胞毒性T淋巴细胞而发挥抗肿瘤免疫作用。

本课题组曾在鼻咽癌组织中发现，肿瘤相关巨噬细胞高密度表达者的无瘤生存率明显高于低密度表达者的无瘤生存率，但其对鼻咽癌进展和预后的影响仅为初步探讨,未针对肿瘤微环境进行观察，且当时研究的临床病例数较少(60例),随访时间较短(3年),患者预后需要进一步观察[11]。因此，在本研究中，我们收集了557例鼻咽癌患者5年完整随访资料，并对其组织芯片中癌巢和间质不同部位的CD68标志物进行免疫组化检测，发现CD68+巨噬细胞在肿瘤间质中浸润比癌巢中明显增多。癌巢中的CD68+巨噬细胞数量与NPC患者的无瘤生存时间及总体生存时间显著正相关。间质中的CD68+巨噬细胞数量与NPC患者的无瘤生存时间及总体生存时间亦显著正相关。提示CD68+巨噬细胞在鼻咽癌中可能发挥抗肿瘤的免疫作用。单因素Cox比例风险模型显示，癌巢中的CD68+巨噬细胞浸润数量增多的患者发生治疗后转移复发及死亡的风险较低。同样的，间质中的CD68+巨噬细胞浸润增多的患者发生转移复发及死亡的风险降低。由此可见，免疫微环境中的巨噬细胞在癌巢或间质中的浸润在鼻咽癌中均倾向于促进机体的免疫应答,均抑制肿瘤的复发和转移,这为临床研究鼻咽癌的免疫治疗提供了新思路。

[1] Amerasekera S,Turner M,Purushotham AD.Paget’s “seed and soil” hypothesis revisited[J].J Buon,2004,9:465-467.

[2] Mueller MM,Fusenig NE.Friends or foes-bipolar effects of the tumour stroma in cancer[J].Nat Rev Cancer,2004,4:839-849.

[3] Pollard JW.Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis[J].Nat Rev Cancer,2004,4:71-78.

[4] Junttila MR,de Sauvage FJ.Influence of tumour microenvironment heterogeneity on therapeutic response[J].Nature,2013,501 (7467):346-354.

[5] Noy R,Pollard JW.Tumor-associated macrophages:From mechanisms to therapy[J].Immunity,2014,41(1):49-61.

[6] Dondossola E,Rangel R,Guzman-Rojas L,et al.CD13-positive bone marrow-derived myeloid cells promote angiogenesis,tumor growth,and metastasis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110 (51):20717-20722.

[7] Knowles H,Leek R,Harris AL.Macrophage infiltration and angiogenesis in human malignancy[J].Novartis Found Symp,2004,256:189-200.

[8] Lewis CE,Pollard JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res,2006,66:605-612.

[9] Sato E,Olson SH,Ahn J,et al.Intraepithelial CD8+tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer[J].Proc Natl Acad Sci,2005,102:18538-18543.

[10] Gao Q,Qiu SJ,Fan J,et al.Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection[J].J Clin Oncol,2007,25:2586-2593.

[11] 彭娟,丁童,郑利民,等.肿瘤相关巨噬细胞对鼻咽癌进展和预后的影响[J].癌症，2006,25(11):1340-1345.

InfluenceofCD68+MacrophagesinDifferentPartsintheTumorMicroenvironmentonProgressionandPrognosisofNasopharyngealCarcinoma

CAI Manbo,SHAO Jianyong,ZENG Yixin,et al

(DepartmentofRadiotherapy,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveThis study was to investigate the influence of tumor-associated macrophages on the progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods557 nasopharyngeal carcinoma paraffin specimens were collected in cancer center of Sun yat-sen university.Immunohistochemical staining method was used to detect macrophages molecular markers CD68,observe and count CD68 express numbers in nests and stroma,statistics are used to analyze the relationship between the positive cells from different parts with the clinical pathological characteristics and the prognosis of NPC patients.ResultsCD68+macrophage infiltration in the stroma was more active than that in the nests (median:4.47 / HPF:1.87/HPF).Kaplan-Meier survival curve and the log-rank statistical analysis results show that the number of CD68+macrophages in nests had significant positive correlation with disease-free survival time and overall survival of NPC patients.The number of CD68+macrophages in interstitial also had significant positive correlation with disease-free survival time and overall survival of NPC patients.Single factor Cox proportional hazards model shows that the recurrent transfer (HR=0.667,P=0.667) and death (HR=0.626,P=0.626) risk is lower with the more infiltration of CD68+macrophage in the nests than a small number of patients after treatment.More number of CD68+macrophages in the stroma has lower recurrence of transfer (HR=0.664,P=0.664) and death risk (HR=0.66,P=0.66) of patients after treatment in patients than a small number.ConclusionThe number of CD68+macrophages infiltration in the nests and stroma of the immune microenvironment was positively related with the prognosis of NPC patients,and it reduced the risk of local recurrence and distant metastasis.

tumor microenvironment,nasopharyngeal carcinoma; CD68; macrophages

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.005

2016-01-21；

2016-04-15

国家高新技术研究和发展计划(863计划) (No:2012 AA02A501),国家基础研究发展计划(973计划) (No:2011 CB504805,2011 CB504300)，国自基金(81272960)和省重点项目(2013WK2010).

*通讯作者，E-mail：jhzuoch@sina.com.

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秦旭平)