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(1.南华大学附属第二医院检验科，湖南 衡阳 421001； 2.南华大学病原生物学研究所)

·基础医学·

梅毒螺旋体纤连蛋白结合蛋白Tp0136前炎症活性的研究

肖勇健1,2，刘卓然1，赵飞骏2，余坚2，曾铁兵2

(1.南华大学附属第二医院检验科，湖南 衡阳 421001； 2.南华大学病原生物学研究所)

目的初步研究梅毒螺旋体纤连蛋白结合蛋白Tp0136潜在的前炎症活性。方法构建重组质粒pET-28a/Tp0136并诱导其表达目的蛋白；将不同浓度(1、2、5、10 μg/mL)的rTp0136分别刺激THP-1源性巨噬细胞，ELISA法分别检测其产生前炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；并同时用二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预先处理巨噬细胞，检测相应细胞因子分泌量。结果成功构建了pET-28a/Tp0136重组质粒，并诱导表达和纯化出rTp0136；重组蛋白能诱导巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α，并且呈浓度和时间依赖性；重组蛋白刺激经PDTC预处理后的巨噬细胞，其IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分别降至32%、35%和27%。结论rTp0136可诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子，该过程可能受NF-κB调控。

梅毒螺旋体； 纤连蛋白结合蛋白； Tp0136； 前炎症细胞因子； 核因子kappa B

梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一种性传播疾病(STD)，其病程较长，临床症状复杂多变，并且其与AIDS的发生发展密切相关[1]。上世纪90年代以来，全球每年大约有1 200万梅毒新发病例，已严重危害公众的身心健康[2]，成为我国乃至全世界共同面对的社会问题和公共卫生问题[3-4]，而对于Tp致病机制的阐明将为梅毒的防治提供有力的理论基础。

纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding proteins,FnBP)作为病原体上的膜蛋白，在粘附宿主、定植等的过程中具有非常重要的作用，是造成宿主感染的一种非常重要的毒力因子[5-6]。Tp0136为近年来新发现的一种Tp主要的FnBP[7]，其主要介导Tp与宿主细胞的结合，也可介导Tp结合细胞间质中的Fn，是机体较早接触的Tp膜蛋白之一，在感染早期可引起宿主产生较强的体液免疫应答，此外，Tp0136是否具有与其他膜脂蛋白[8-10]类似前炎症效应，目前尚不明确。本文将探讨Tp0136潜在的炎症活性以及激活是否受NF-κB调控，为阐明Tp0136在Tp感染所致损伤中的作用提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料和试剂

1.1.1 菌株和质粒 Tp Nichols标准株、表达菌E.coliBL21(DE3)、pET-28a质粒、人单核细胞(THP-1)均为南华大学病原生物学研究所保存。

1.1.2 试剂和试剂盒 Pfu PCR MasterMix试剂盒(北京天根公司)、辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗人IgG(大连宝生物公司)；DNA分子量标准、蛋白分子量标准(北京天根公司)；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶(NEB公司)；Ni-NTA亲和层析柱、PCR产物回收试剂盒(Qiagen公司)；BCA微量蛋白测定试剂盒(Pierce公司)、ECL蛋白印迹法检测试剂盒(Pierce公司)，Detoxi-GelTM内毒素去除胶(Thermo Scientific公司)，显色基质鲎试剂盒(厦门鲎试剂公司)，IL-1β、IL-6和TNF-α 试剂盒(R&D生物制剂有限公司)。

1.2方法

1.2.1 Tp 0136基因的扩增 在线(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获取Tp 0136的全基因序列(基因编号：CP004010)，应用Signal P 4.1软件作信号肽序列分析(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，去除信号肽序列，设计引物(由上海生工合成)，上游引物F:5′-CGGGATCCCGCGATTTCACTGGCATCTTTG-3′，下划线为BamHⅠ酶切位点，下游引物R:5′-GGAATTCCTACTCGCGGTTCCAGGAGCA-3′，下划线为EcoRⅠ酶切位点；PCR扩增体系:2×Pfu PCR MasterMix 12.5 μL、10 μmol/L引物各1 μL、Tp DNA模板2 μL、加ddH2O补至25 μL。扩增条件:94 ℃5 min;94 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s，共35个循环；72 ℃ 延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪(Bio-rad公司)中观察目的条带。回收、纯化PCR产物，备用。

1.2.2 重组体pET-28a/Tp 0136的构建与鉴定 将纯化后的PCR产物和pET-28a质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，再用T4连接酶将按比例混合的酶切产物进行连接、转化至处于感受态的克隆菌E.coliJM 109中，培养48 h后筛选阳性克隆，作酶切鉴定和PCR鉴定，初步鉴定的阳性质粒送上海生工公司进行测序。再将经测序鉴定正确的pET-28a/Tp 0136转化至表达菌E.coliBL21(DE3)中构建重组表达体。

1.2.3 Tp 0136重组蛋白的表达、纯化及鉴定 IPTG诱导重组体pET-28a/Tp 0136表达目的蛋白，同时设未诱导组及阴性对照组，SDS-PAGE分析表达结果。大规模诱导重组菌，收集菌体，加入溶菌酶作用，超声裂解菌体后离心收集沉淀制备包涵体，包涵体充分溶解后用Ni-NTA亲和层析柱纯化，具体操作步骤按试剂盒中说明书。纯化产物采用尿素梯度透析复性后，作SDS-PAGE分析及Western blot鉴定；按BCA法测定重组蛋白的浓度；重组蛋白经Detoxi-GelTM内毒素去除胶过柱，然后用显色基质鲎试剂盒测定其内毒素含量。

1.2.4 THP-1细胞培养及刺激试验 于RPMI-1640培养基(含10% 胎牛血清)中加入人单核细胞系THP-1细胞，置37 ℃，5% CO2恒温细胞培养箱中培养，每3天传代1次。于传代后第1天收集细胞，按1×106/mL细胞数接种于细胞培养板中，每孔加至2 mL RPMI-1640培养基，为刺激THP-1细胞转化为巨噬细胞，再加入终浓度为100 nmol/L的佛波酯(PMA)，继续培养2天后，实验组分别加入终浓度为1、2、5、10 μg/mL重组蛋白的无血清培养液，继续培养。另外，为评价Tp 0136重组蛋白刺激巨噬细胞产生CKs的时间依赖性，于培养液中加入终浓度为5 μg/mL的重组蛋白分别培养6、12、24、48、60、72 h。各实验组均设LPS (100 ng/mL)为阳性对照、PBS为阴性对照。各组均设3个平行试验。为了评价CKs的分泌是否受NF-κB通路的调控，另用25 μmol/L PDTC 预处理巨噬细胞30 min，再以5 μg/mL的重组蛋白刺激巨噬细胞，继续培养24 h。

1.2.5 ELISA检测CKs 将已贴壁的巨噬细胞用PBS吹打、冲洗3次，再用0.1% Triton X-100处理30 min，反复冻融细胞2次，离心，收集上清液，按ELISA试剂盒说明书测定上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.3统计学方法所有实验均重复3次，实验数据用均数±标准差表示，运用SPSS13.0软件，均数之间比较采用t检验和One way ANOVA方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1重组体pET-28a/Tp 0136的鉴定以重组质粒为模板，PCR扩增出约1 400 bp的DNA片段，与预期结果相符；重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到与PCR产物一致的条带(图1)；测序结果经BLAST后证实与GenBank中公布的Tp 0136序列完全一致。

图1 pET-28a/Tp 0136重组质粒双酶切鉴定及菌液PCR鉴定 1:DNA marker;2:以Tp Nichols 株DNA为模板的扩增产物;3:pET-28a/Tp 0136双酶切;4:重组质粒的扩增产物;5:PCR阴性对照

2.2 Tp 0136重组蛋白的表达、纯化及鉴定含pET-28a/Tp0136的E.coliBL21经IPTG诱导后，表达出一分子量约50 kDa大小条带的目的蛋白，与预期结果相符(见图2A)；存在于包涵体的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化柱以及pH梯度洗脱法纯化，见图2B；纯化后目的蛋白用尿素梯度透析复性后，分别以6×His-Tag单抗和梅毒患者血清为一抗作WB鉴定，结果显示在相应位置出现单一特异性条带，见图3；BCA法测定蛋白浓度为270 μg/mL；重组蛋白经内毒素去除胶去除所含内毒素后，用鲎试剂检测其内毒素含量<0.04 EU/mL，符合后续试验要求。

2.3 Tp 0136重组蛋白刺激THP-1源性巨噬细胞产生CKs rTp 0136呈现以剂量依赖方式和时间依赖方式刺激巨噬细胞产生CKs(图4)。用重组蛋白刺激巨噬细胞后，能明显诱导后者产生IL-1β、IL-6和TNF-α，其产量并且随着蛋白浓度的增加而增加，至5 μg/mL达到峰值，峰值分别为195.51±14.73 pg/mL、170.19±4.38 pg/mL、1732.90±44.52 pg/mL，随后呈下降趋势，实验组CKs的分泌量均明显高于同浓度的对照组，经t检验和One way ANOVA方差分析，得IL-1β组(F=216.179,P=0.00)、IL-6组(F=283.275,P=0.00)和TNF-α组(F=1880.739,P=0.00)，其差异有统计学意义。当用5 μg/mL rTp0136刺激巨噬细胞，在24 h内随刺激时间增加，诱导巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也增加，其中TNF-α的水平于24 h时达到高峰，为1662±87.9 pg/mL，IL-1β、IL-6的水平于48 h时达到高峰，为332.5±16.4 pg/mL、145.7±11.4 pg/mL(图4B)。

图3 Tp 0136重组蛋白的WB鉴定 1:阴性对照;2:梅毒患者血清;3:6 × His-Tag单抗

2.4 NF-κB与CKs产生的关系巨噬细胞经PDTC预处理后，rTp0136刺激其IL-1β、IL-6和TNF-α 的产量分别降至对照组(经DMSO处理)32%、35%和27%，见图5。rTp0136刺激巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α可能受NF-κB通路的调控。

3 讨 论

Tp目前尚未证明有明显的致病物质，如荚膜、内毒素和外毒素等致病因子。资料表明[5-6]，病原菌外膜上的FnBP能与ECM的纤连蛋白(Fn)结合，在细菌粘附宿主细胞等的过程中具有非常重要的作用，是引起宿主感染重要的毒力因子。同样Tp外膜蛋白中的FnBP在Tp入侵宿主的初始阶段，如粘附、定植等致病环节中也发挥着重要作用[7]。此外，Tp感染宿主后，细胞免疫在致病过程中起着重要作用[8]，一方面能清除螺旋体，另一方面又导致局部组织病理损伤，这主要是由于Tp在感染部位繁殖后，某些菌体成分可激活局部或/和邻近的单核/巨噬细胞，诱导合成和释放一系列炎性介质，引起炎症反应，形成梅毒下疳。

图4 梅毒螺旋体纤连蛋白rTp0136以剂量和时间依赖方式诱导THP-1源性巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α A:分别用不同浓度重组蛋白刺激巨噬细胞后，IL-1β、IL-6和TNF-α的产生量，其中LPS为阳性对照，PBS为阴性对照(均为三次平行试验);B:5 μg/mL rTp0136刺激巨噬细胞后，在不同时间点IL-1β、IL-6和TNF-α的产生量(均为三次平行试验)

图5 NF-κB抑制剂PDTC对巨噬细胞分泌CKs的影响

目前已有研究[8-10]表明，Tp的膜蛋白TpN47、TpN17、Tp0751和Tp0663均可诱导单核/巨噬细胞释放前炎症细胞因子。Tp 0136作为一种膜脂蛋白，属于FnBP家族，在感染早期，即可产生较强的体液免疫应答[11]，另外，Tp 0136主要依靠其氨基末端结合宿主细胞的Fn[12]，从而使螺旋体粘附于宿主细胞，为病原体在局部定植提供保证，但其是否具有促前炎症活性作用还不明确。本研究采用人单核细胞(THP-1)源性的巨噬细胞为研究对象，在体外环境模拟人体对Tp感染后的免疫应答。IL-1β、IL-6和TNF-α是重要的促炎因子，能介导机体的炎症反应和免疫调节等。本研究显示，Tp 0136蛋白能诱导人巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，分泌量与蛋白浓度和诱导时间呈一定的依赖关系。随着刺激浓度增大，分泌量亦增加，在蛋白刺激浓度为5 μg/mL，IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量达到高峰；在刺激时间上，TNF-α出现峰值时间在24 h，而IL-1β、IL-6峰值时间在48 h。当高于此浓度和此刺激时间后，CKs的产生量明显减少，可能是由于浓度过高和刺激时间过长会干扰巨噬细胞正常的生物学功能，从而导致CKs分泌的减少[9]。

NF-κB作为一个早期转录因子，是各种炎症反应的共同通路，参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子(其中包括IL-1β、IL-6和TNF-α)都受到其调控，在多种生理及病理情况下有重要作用[13]。本文利用NF-κB特异抑制剂PDTC预处理巨噬细胞后，发现其能明显抑制rTp0136诱导的NF-κB活化，使IL-1β、IL-6和TNF-α分泌减至20%～30%左右，表明rTp0136诱生THP-1源性巨噬细胞产CKs可能经NF-κB通路调控。

由于Tp至今尚不能体外人工培养[8]，很大程度上制约了对其深入研究。本研究利用分子克隆技术，成功表达去信号肽的rTp0136，初步证实Tp0136蛋白作为一种膜脂蛋白，具有与TpN47、TpN17、Tp0751和Tp0663等类似的前炎症活性，在体外能够诱导人巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α等前炎症因子，该过程可能受NF-κB通路的调节。诚然，本研究尚有不足之处，比如Tp0136蛋白是否还可刺激巨噬细胞产生其他的细胞因子，该过程是否还受到其他信号通路的调节，比如TLR-MAPK通路等，这些均有待进一步证实。

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ProinflammatoryActivityofRecombinantFibronectin-BindingProteinsTp0136ofTreponemaPallidum

XIAO Yongjian,LIU Zhuoran,ZHAO Feijun,et al

(ClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore potential proinflammatory activity of the Treponema pallidum fibronectin-binding protein (FnBP) Tp0136.MethodsThe recombinant pET-28a/Tp0136 was constructed and induced to express the targeting protein inE.coliBL21.In vitro various concentrations of protein was used to stimulate human macrophages derived from THP-1 cell line at different time.ELISA was performed to detect the level of proinflammatory cytokines IL-1β,IL-6 and TNF-α;Recombinant protein was used to stimulate the macrophages pre-treated with PDTC,and ELISA was performed to detect the releasing IL-1β,IL-6 and TNF-α respectively.ResultsThe recombinant plasmid was constructed and the corresponding recombinant protein was obtained successfully;rTp0136 could induce production of IL-1β,IL-6 and TNF-α in dose- and time-dependent manners significantly.Secretion of IL-1β,IL-6 and TNF-α decreased to 32%,35% and 27% respectively when macrophages was pre-treated with PDTC.ConclusionThe data suggested that the FnBP Tp0136 could activate the THP-derived human macrophages to release the proinflammatory cytokines,which might be regulated via NF-κB.

Treponema pallidum; fibronectin-binding protein (FnBP); Tp0136; proinflammatory cytokines; NF-κB

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.006

2015-11-17；

2016-04-20

湖南省医药卫生科研计划项目(No:B2012-055)；湖南省科技厅一般项目(No:2014TT2025)；湖南省医药卫生科研计划项目(No:B2013-035).

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蒋湘莲)