赵雨杰， 钟连声， 何 群， 梁 彬， 王绍成， 潘忠诚， 王天骄

(中国医科大学 教育部细胞生物学重点实验室生物芯片中心，辽宁 沈阳 110122)



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生物芯片在微生物学研究中的应用

赵雨杰， 钟连声， 何 群， 梁 彬， 王绍成， 潘忠诚， 王天骄

(中国医科大学 教育部细胞生物学重点实验室生物芯片中心，辽宁 沈阳 110122)

生物芯片是用于检测生物样品中生物分子及生化指标的微小装置，根据其检测靶标不同分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片及生化芯片；根据其结构和工作原理不同分为阵列型芯片、液体芯片和微流体芯片。由于具有微量化、并行性、快速、高通量和自动化检测的特点，生物芯片被广泛地应用于生物学研究领域。本文重点论述生物芯片在微生物学研究中的应用。

生物芯片；微生物学；基因检测；蛋白检测

生物芯片(biochip) 是20世纪90年代初出现的一种新型高通量、并行分析的微量分析技术。生物芯片是构建在固体载体(如玻璃、玻璃片、金属或塑料)上的微小检测装置。阵列型生物芯片可以将大量已知的生物探针(核酸、蛋白、糖以及生物活性基团)以点阵的形式固定排列在固体表面，在一定的条件下与待检样品进行生物学反应，可以用荧光法、化学发光法、酶标法及同位素法显示反应结果。利用二维精密扫描仪等仪器进行数据采集。微流体芯片的特点是在固体载体上构建微流道、储液池、反应池、微泵、微阀、理化处理装置及检测装置等，实现对生物样品的分离、反应、分析等功能。液体芯片是将编码的微珠与已知的生物探针结合，然后将标记生物探针的微珠加入到含有待检的荧光标记样品的溶液中，待反应完成后利用流式微珠荧光检测装置分析检验结果。生物芯片技术是融生命科学、物理学、化学、微电子学和计算机科学于一体的崭新技术。通过选择不同的生物芯片设计和使用特定的分析方法, 生物芯片可应用于不同的生命科学研究领域。由于具有微量、高通量、快速、微型化和自动化的特点, 生物芯片技术在微生物学研究中有着广阔的发展前景。

1 生物芯片的分类

生物芯片分类具有多种方式,根据其构造不同可分为阵列型芯片、微流体芯片和液体芯片；根据其分析的靶标不同可分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等； 根据其应用不同可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片、基因组SNP分析芯片、基因组染色体变异分析芯片以及药物分析芯片等。

1．1 阵列型芯片

微阵列生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片等生物芯片，所谓微阵列芯片是将数十甚至几万种生物探针分子以阵列的形式固定在厘米级别的固体载体上，利用生物分子间的相互作用, 俘获样品中的靶分子, 通过荧光、化学发光、酶标显色及同位素放射显影分析阅读系统读取每个位点的复杂信息[1-2]。高达8×103数量的生物探针可以被点样在一张2 cm×4 cm的基板之上, 每个探针位点的直径约为75～100 μm, 探针之间的距离约为150 μm[3]。目前，Affymetrix公司生产芯片采用原位光刻技术，可以在每平方厘米基片上合成超过400万种探针的微阵列位点[4]。HuProtTM人类蛋白质组芯片，芯片覆盖约17 000种人类重组蛋白。该芯片可以应用于疾病血清谱、抗体特异性、蛋白质相互作用、泛素和SUMO的E3连接酶和蛋白激酶等底物筛选的研究。利用微阵列生物芯片, 研究者可在数十分钟内完成对整个基因组或蛋白质组的分析。基于这种快速、高效的特点, 微阵列生物芯片在生物学和医学等领域获得了广泛应用, 包括测定基因/蛋白质表达图谱、研究特定的基因/蛋白质功能、研究分子间交互作用、寻找疾病的生物学标记、药物靶标微生物鉴别以及微生物族群分析等。

1.2 液体芯片

液体芯片是利用聚苯乙烯微球中掺入两种不同比例荧光染料的方法将微球编码为100余种不同的微珠，不同荧光编码微球分别共价包被特异的基因探针或蛋白探针来特异结合待检样品中的靶标分子，溶液中靶标分子事先被标记上相应的报告荧光分子；将微球加入到含有荧光标记待检样品中进行生物学反应，反应完成后利用流式荧光检测技术依次检测编码微球与待检样品中靶标分子反应情况，如果某一编码微球携带靶标分子的报告荧光分子，就可以判定该编码微球包被的探针与待检样品中的靶标分子发生了反应，通过计算机的分析处理，确定微球结合的分析物的定性和定量信息。液体芯片微球表面分子杂交或免疫反应在悬浮溶液中进行，具有较高的反应速度和反应效率，反应所需时间短，灵敏度可达0.01 pg/μL。检测特异性强，背景低。可同时得到定性和定量指标。目前，液体芯片技术可开展不同类型的工作，如微生物鉴定、免疫分析、核酸序列研究、酶学分析、受体和配体识别分析等。

1.3 微流体芯片

微流体芯片是当前微全分析系统(μ-TAS)发展的热点领域。在固体片基上构建微流道、微泵、微阀、反应器、混合器、过滤器、分离器等微小装置，实现生物样品的制备、生物化学反应、液相色谱分析、PCR反应、电泳检测等操作。如果要将样品制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上，可以将实验所用流体的量从毫升、微升级降至纳升或皮升级，功能强大的微流体装置可以取代现有实验室的常规操作，它的目标是把整个实验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上。因此，在微生物研究中，它不仅可以用于单个细胞微生物生化代谢研究，更适合用于微环境改变对微生物生物学行为影响的研究。

2 生物芯片在微生物学研究中的应用

2．1 生物芯片在食品微生物检测中的应用

Manzano等[5]使用深蓝色有机发光二极管作为激发光源，研制了一种高灵敏度和高特异性的DNA生物芯片，该光源可以高效激发与DNA探针结合的荧光集团，可对肉类样品进行检测。与传统检测方法比较，他们构建的便携式生物芯片诊断系统用于检测家禽肉类食品中空肠弯曲杆菌污染，所需检测时间更短，并且灵敏度达到0.37ng/μL。Bajwa等[6]研制的微型生物传感器系统，可以快速检测和计数食物或水样品中微生物在琼脂培养层中的数量。他们开发了一种高灵敏度的阻抗生物传感器阵列，监测分散在琼脂培养基上细菌克隆的生长状态，芯片上制备了复合网络阵列，连续检测、记录培养基不同局域的电特征变化，复合网络阵列中不同生物传感器的信号变化可以反应样品中细菌的生长和细菌克隆的位置。这种技术方法是检测食物样品细菌污染的快速非标记检测方法，只用常规菌落计数方法的四分之一时间即可完成检测。2010年，Heidenreich等[7]利用RNA-DNA杂交取代传统的微生物检测方法，构建了电化学生物芯片检测食物中致病菌和酸败菌，他们提取牛肉和猪肉肉汁，经酶消化后提取总RNA，经过5 h富集处理检测灵敏度可达到2 000 cfu/mL，若经过7 h富集可达到1 cfu/mL。

2.2 生物芯片在环境微生物检测中的应用

Jing等开发了基于培养生物芯片可以应用于环境样品中分支杆菌快速检测，他们利用10～26 GHz微波，快速检测生物芯片表面微生物质量。结果表明，不同微生物在不同频率条带出现特异的共振现象，在2 h内可以快速确定和分析环境样品中分支杆菌[8]。Chandler等[9]开发了双邻近伴侣探针检测系统，该芯片包含物种特异性的捕获探针和另一个标记的邻近伴侣探针，用于检测环境样品中完整16S rRNAs，他们利用22个碱基的捕获探针和15个碱基检测探针，相互间隔10～14个碱基，可以捕获物种特异的具有二维平面结构的16S rRNA。Yagur-Kroll等[10]构建了实时细菌报告装置，利用多孔氧化铝建成流动池芯片，具有微生物传感器功能，这种廉价、易于安装多孔氧化铝流动池生物传感器可以用于将来水质量检测技术平台。Cong等[11]使用一种芯片宏基因组的工具——GeoChip 5.0，研究微生物功能基因多样性和诱发因素,发现热带雨林中土壤微生物功能基因存在高度多样性和在生物地球化学进程中土壤微生物代谢潜能发生改变。经过实验研究、数据处理和土壤生物地球化学分析证明土壤有效氮与土壤微生物功能基因结构最为相关。Gao等[12]指出宏基因组芯片GeoChip 4.0分别检测西藏4个不同海拔高度山区草场地点土样中微生物功能基因表达谱，调查微生物对气候变化的反应。发现4个不同高度微生物群落不同，土壤的pH、温度、NH4(+)-N和植被的差异是影响土壤微生物群落4个主要因素。Yin等[13]为了探索微生物群落对环境胁迫反应的生态学问题，观察微生物对重金属(铬、锰和锌)污染的反应，使用16S rRNA扩增测序和功能基因组芯片检测方法，研究沉积微生物群落组份、结构和功能潜能。16S rRNA扩增测序分析发现，随着重金属污染程度不同沉积微生物组成和结构发生明显变化，在高污染样品中厚壁菌门、绿弯菌门和泉古菌门相对丰度提高，而变形杆菌门和放线菌门丰度降低，相应的关键功能基因包括金属内稳态(如chrR、metC、merB)、碳代谢和有机修复基因在高污染样品的细菌中丰度较高，提示在污染区域的细菌群落可能调整了能量代谢和有机修复能力。这项研究表明原生沉积微生物群落通过改变组份、结构、功能优先和相互作用网络提高它们的适应能力和/或抵抗环境污染。Ghobakhlou等[14]使用含有5 760种北极根瘤菌基因克隆的基因芯片，研究8种来源于不同温度条件的strain N33根瘤菌，给予持续的和瞬态冷处理后与室温生长的细胞对比，持续低温(4、10 ℃)处理细胞与短时间(<60 min)冷处理细胞相比出现明显的诱导基因数量不同，但当延长冷处理(240 min)后表达谱的变化介于两者中间。最明显上调的基因编码蛋白质包括代谢物转运、转录调控、蛋白翻转、氧化还原酶活性、防冻保护(甘露醇、多胺)、脂肪酸代谢和膜流动性相关蛋白质。冷处理期间，N33根瘤菌主要影响的基因是糖转运和蛋白转运、酯类生物合成和NADH氧化还原酶活化相关基因，分泌、能量生成和转化、氨基酸转运、细胞运动、细胞胞膜和外膜生物生成功能相关基因明显下调。这些表明生长停止或下降，可能是在寒冷应激条件下调解细胞功能和保存能量的重要策略。上述相关基因可能是N33根瘤菌寒冷适应性反应相关基因。

2.3 生物芯片在病毒检测中的应用

Gryadunov等[15]介绍了利用微阵列分子技术鉴别肝炎病毒HCV基因型和亚型技术方法，他们利用HCV病毒基因组的NS5B基因片段构建基因型和基因亚型120个寡核苷酸探针，可以鉴别HCV基因型，尤其是可以实现鉴别临床难以鉴别的耐药HCV亚型。Leblanc等[16]使用生物素标记方法使疫病毒扩增产物与芯片结合然后用磁珠进行检测，可以检测4种疫病毒种类。与其他检测方法相比，具有更高的检测灵敏度。实验结果表明：这种磁珠结合芯片检测方法具有高灵敏度、高特异性和检测简单等优点，是检测致病病毒有效的方法。Hua等[17]为了研究HBV基因型与药物抵抗的相关性，使用实时定量PCR和基因芯片检测了620名慢性乙肝患者血清中HBV基因型(HBV/B、C、D)和耐药相关的热点基因变异位点。在这些患者中76.0%患者的HBV病毒属于C基因型，76.0%属于B基因型，2.7%属于药物核苷类逆转录酶抑制剂 (NA)抵抗型基因变异。C基因型HBV病毒比B基因型HBV病毒更易出现药物抵抗变异。Lin等[18]研发了一种低成本的免疫传感器用于快速检测亚洲流行的AI H5N1病毒，可在1 h时内检测禽样品拭子上H5N1病毒。特异的抗AI H5N1病毒抗体是由小鼠骨髓瘤细胞与H5N1病毒免疫的小鼠脾细胞融合产生的，使用斑点ELISA分析证明这个抗体与H5N1病毒有很好的亲和力和特异性。微电极表面使用抗AI H5N1病毒抗体修饰，最低检测限为2(-1) HAU/50 μL，与H6N2、H9N2、新城疫和禽传染性支气管炎病毒无交叉反应。Roh等介绍了一种新的RNA寡核苷酸量子点生物芯片，用于特异性和高灵敏度检测病毒蛋白方法。该方法是将HCV非结构蛋白5B(NS5B)固定在玻璃芯片表面，使蛋白氨基集团与玻璃芯片上的手臂分子形成共价键。5′端胺基修饰的RNA寡核苷酸与量子点表面羧基结合形成RNA寡核苷酸包被量子点。RNA寡核苷酸包被量子点与生物芯片上病毒蛋白NS5B相互反应将其固定，此方法检测的线性范围在1 mg/mL～1 ng/mL。RNA寡核苷酸纳米颗粒分析的最大优点是特异性很高，易于操作，并且可用于HCV常规检测，也可以用于其他类似疾病的检测[19]。

2.4 生物芯片在其他微生物研究中的应用

Yin等[20]使用全基因组基因芯片观察嗜酸氧化亚铁硫杆菌在40 ℃时处理后，用全基因组芯片检测基因表达谱，结果发现，与异养菌热胁迫反应不同，嗜酸氧化亚铁硫杆菌能量代谢变化更加显著，使人们更加深入了解自养菌热休克反应的机制。Thomassen等[21]使用叠瓦式基因芯片研究紫外线诱导大肠埃希菌SOS反应，观察微生物紫外辐射引起转录组变化，结果发现，在紫外处理的细胞中，除了常规SOS反应基因外，出现了一组新的差异表达转录子，这些转录子可能在调解细胞对紫外损伤反应过程中起重要的作用，部分转录子是非编码RNA(ncRNA)，有些上调的转录子编码一些短肽，这些短肽具有生物学活性。Nunes等[22]用基因芯片检测分析5～120 h，巴西副球孢子菌mycelium-to-yeas转化过程中4 692个基因表达变化情况。研究结果发现2 583个与编码氨基酸降解酶、信号转导、蛋白合成、细胞壁代谢、基因组结构、氧化应激反应、生长控制和发育有关基因发生明显变化。其中4-HPPD基因明显过度表达，使用NTBC特异性抑制4-HPPD表达可以在体外抑制巴西副球孢子菌生长和分化。

3 展 望

最早出现的生物芯片是阵列型基因芯片，用于基因序列分析。全基因组基因芯片用于组织细胞中基因的表达谱分析，但目前全基因组基因芯片种类有限，应该开发开放的基因芯片设计和制备系统，根据用户需求定制不同物种的基因芯片。随着科技的发展，会研发出更多的微生物基因表达芯片和微生物群落分析芯片。目前生物芯片检测低丰度mRNA 转录本的灵敏度和种类尚需提高，以满足微生物功能多样性，揭示其活动规律的研究。微流体芯片的发展结构越来越微型化和复杂，功能在不断增加，使用范围越来越广，在探索特殊生态环境下微生物生物学特性和未知微生物的研究方面会得到有效的应用。蛋白芯片的发展趋势是多功能化和检测探针数量不断增加，不仅可以用于微生物物种的鉴别，还可以进行功能性研究，如病原体与微生物免疫反应机制研究、微生物体内蛋白相互作用网络研究、微生物生物活性物质研究以及微生物相互作用研究等。如何提高检测特异性和降低芯片成本是生物芯片研发的永久性课题，只有提高检测特异性和降低成本才可以使生物芯片的应用范围更广、更实用。生物芯片技术的不断发展和完善，将为微生物资源、分类、系统学、多样性、群体遗传与演化、协同代谢分子机理、环境微生物学、工业微生物学、系统生物技术、微生物生理学、微生物代谢、微生物生态学、微生物生化工程、分子病毒学、分子免疫学研究提供高效、便利、快捷的技术手段。生物芯片技术既具有重大的基础研究价值，又具有明显的高新技术产业化前景，在不久的将来会出现具有良好经济和社会效益的高新技术产业。

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Applications of Biochip in microbiological research

ZHAO Yu-jie, ZHONG Lian-sheng, HE Qun, LIANG Bin, WANG Shao-cheng,PAN Zhong-cheng, WANG Tian-jiao

(BiochipCenter,ChinaMedicalUnivecity,Shenyang110122)

Biochip is a tiny device used to detect biological molecules and biochemical indicators in biological samples. according to its test target, biochip is divided into: gene chip(DNAmicroarray), protein chip, cell chip, tissue chip and biochemical chip; According to its structure and working principle is divided into: the microarray, liquid chip and microfluidic chips. Because of the detection characteristics oftrace amount, parallelism, high throughput, and automation, biochip isnow widely used in the field of biology. This paper mainly discusses the application of biochip in microbiology research.

Biochip；Microbiology；Gene detection；Proteindetection

赵雨杰，博士，中国医科大学教授，博士生导师。1992年考入中国医科大学生物物理专业攻读硕士学位，1995年获理学硕士学位。1995年考入苏州医学院放射生物学专业攻读博士学位，1998年获医学博士学位。1998年起在东南大学教育部分子与生物分子电子学重点实验室进行博士后研究工作。在东南大学期间作为主要负责人主持基因芯片应用研究课题组科研工作。主持国家863基因芯片的研究和应用课题，主要承担973国家重点基础研究发展规划项目 “恶性肿瘤发生与发展基础性研究”与癌症相关的基因芯片研究工作。获得2000年国家自然科学基金项目“基因芯片在片合成核苷酸的动力学研究”资助。2000年9月 作为人才引进到中国医科大学卫生部重点实验室——细胞生物学实验室，任中国医科大学生物芯片中心主任和沈阳生物芯片中心主任。2001年创建中国医科大学生物信息学教研室。获2002年国际尤里卡专利发明金奖。被遴选为辽宁省科技“百、千、万”人才计划百人计划成员。现任国家自然科学基金委员会、生命科学部预防医学与免疫学学科项目评审专家，国家863计划“微机电系统”预启动项目评审专家，中华中西医杂志常务编委，辽宁省生物物理学会理事长。主持国家、省、市自然科学基金多项，已申请国家专利14项，主编《医学生物信息学》专著。多年来，从事生物芯片研究与开发工作，发表学术论文60余篇。

辽宁省自然科学基金项目(2014021084)

赵雨杰 男，博士，教授，博士生导师。主要从事生物芯片研究。E-mail:yjzhao@mail.cmu.edu.cn

2015-12-17

Q93

A

1005-7021(2016)01-0001-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.001