张艳欣，杨 鑫*，谢冰洁，佘永新，杜鹏飞，邹 攀，

金 芬2，金茂俊2，邵 华2，王珊珊2，郑鹭飞2，王 静2*

(1.哈尔滨工业大学 化工学院，黑龙江 哈尔滨 150090；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)



基于HPLC/Q-TOF MS的4种农药联合暴露人群的代谢组学研究

张艳欣1，杨 鑫1*，谢冰洁2，佘永新2，杜鹏飞2，邹 攀1，

金 芬2，金茂俊2，邵 华2，王珊珊2，郑鹭飞2，王 静2*

(1.哈尔滨工业大学 化工学院，黑龙江 哈尔滨 150090；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)

采用基于高效液相色谱-飞行时间质谱联用(HPLC-TOF MS) 的代谢组学方法，研究了啶虫脒、高效氯氟氰菊酯、联苯菊酯、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐4种农药联合暴露所致的施药人群尿液中内源性代谢物的变化。采集30位农民喷洒4种复合农药前和喷洒农药期1，3，5，7 d的尿液进行检测。提取正常尿液中常见代谢物并通过质控样品评价手段进行分析，结果表明该方法具有良好的稳定性和精密度，可用于尿液中代谢物分析。多变量分析结果表明，暴露人群施药前后尿液的代谢物含量存在较大差异。对选取的36个差异离子进行鉴定，确定了8个生物标志物的结构。结果显示联合暴露组人群尿液中多巴胺、5-羟色胺、酪氨酸、色氨酸、牛磺酸和马尿酸的含量显著下降；犬尿素和肌酸的含量显著上升。4种农药联合暴露导致接触人群尿液中色氨酸代谢途径的中间产物含量降低，肝代谢和能量代谢相关的代谢物蓄积，可能与神经系统和肝脏功能的受损有关。

联合农药；代谢组学；高效液相色谱-飞行时间质谱联用；生物标志物

近年来，农药中毒一直是农民的主要职业危害和农村的主要公共卫生问题，由于农作物多种病虫害并存且害虫普遍表现出耐药性，农民越来越多地将多种农药混合使用[1]。目前混配农药在杀虫剂登记品种中占相当大的比例，农药中毒报告也证实农药混剂中毒事件逐年增多，对使用者的健康造成严重威胁[2]。因此，对不同杀虫剂混配后的联合毒性和机制进行评估意义重大。

多种农药暴露导致的健康危害很难简单地通过对污染物进行传统毒性试验而推断其综合毒性效应。而代谢组学可通过分析机体体液中代谢物谱的变化，探索机体的整体生物学状态[3-7]。中国科学院动物研究所伍一军课题组[8]以目前我国常用的化学农药毒死蜱和甲萘威为研究对象，通过基于核磁共振(NMR)的代谢组学方法，得到了连续单独及混合染毒农药90 d的大鼠血清的1H NMR代谢物谱。通过模式识别技术和多元变量分析发现，毒死蜱和甲萘威单独染毒及复合染毒均可引起大鼠肝脏线粒体能量和脂肪酸代谢紊乱。基因组学和蛋白质组学是研究毒物毒性和毒性机制的有效手段，然而有些毒物可能不影响基因的调节和表达，因此单从基因组和蛋白质组的角度并不能非常准确地评价毒物的毒性[9-10]。但当毒物进入机体后，会引起生物体内多种不同代谢路径上的内源性代谢物的比例、浓度发生变化[11]。将这些代谢物信息与生理过程中的生物学变化联系，可进一步确定相关毒物的特异性生物标志物。Bonvallot等[12]应用HPLC-MS/MS技术分析法国粮食作物产区布列塔尼83名孕妇的尿液，发现处于农药暴露区域的孕妇代谢谱异常，甘氨酸和苏氨酸等上调，柠檬酸下调。Wolff等[13]采集纽约地区不同民族的404位多氯联苯、乙烯和有机磷职业暴露者的尿液，发现对氧磷酶发生明显改变，可作为以上几种污染物的生物标志物。

本文收集山西省万荣县周王村4种农药复合暴露人群的尿液进行毒性评估，该村土地面积4 000余亩，耕地面积3 700多亩，其中3 000亩土地种植桃树，农药使用剂量大。本次喷洒的4种农药为啶虫脒(陕西美邦农药有限公司)、高效氯氟氰菊酯(陕西美邦农药有限公司)、联苯菊酯(青岛东生药业有限公司)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(青岛东生药业有限公司)，喷洒周期为7 d。以喷洒复合农药的农民作为复合农药职业暴露人群，利用基于高效液相色谱法-飞行时间质谱(HPLC-TOF MS)联用技术的代谢组学方法分析其尿液样本，通过多元变量分析找出农药暴露前后不同时间点的差异代谢物，并和代谢物数据库进行匹配，找出潜在的生物标志物，为毒理学家了解人体接触环境中的多种农药可能引起的复合毒性效应提供了重要基础，也为预防医学工作者在制定农药复合污染毒性的防治策略方面提供了有价值的参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1200系列高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)；QSTARTMElite飞行时间质谱(美国AB Sciex 公司)，配有ESI 源；Waters XBridge C8色谱柱(5 μm，150 mm×2.1 mm)；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯,Aldrich公司)；超纯水由美国Milli-Q 超纯水系统(Millipore，Billerica，USA) 制备。

1.2 暴露人群以及样品采集

暴露人群是来自山西省万荣县周王村的30位喷洒复合农药的农民，年龄分布在43～70周岁之间，其中43～50周岁3人；50～60周岁11人；60～70周岁16人。男女各15人。均为了解实验步骤和目的后自愿参加样品收集和调查试验。因整个农药喷洒过程为7 d，所以采集每个农民喷洒农药前1 d和喷洒农药期间1，3，5，7 d的晨尿。尿样采集后立即装入冰盒中寄送至实验室，分装后于-80 ℃保存。

1.3 生物样品制备

实验前将尿液样本在室温下解冻，于4 ℃以12 000 r/min 高速离心15 min除去尿液中的蛋白，用超纯水将尿液上清液稀释4倍，避免浓度太高污染仪器，涡旋振荡1 min，过0.22 μm 水系滤膜，装样品瓶待测。 质控样品(QC) 的制备:将处理后上机待测的尿液样本各取100 μL涡旋振荡混合，取1 mL装样品瓶待测。上机检测时，每5个待测样品间穿插1个QC样品。

1.4 色谱条件及质谱条件

安捷伦1200系列高效液相色谱仪，流动相:A为0.1%甲酸水，B为乙腈，C为甲醇。梯度洗脱程序:0～2 min，90% A；2～40 min，90%～5% A并保持10 min；50～51 min，5%～90% A并保持10 min，回到初始流动相比例；40～50 min，30% B，其他时间为0% B。流速300 μL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

利用QSTARTMElite TOFMS(美国 AB Sciex 公司)正离子扫描模式，雾化气(GS1)为60 psi，雾化气(GS2)为50 psi，气帘气(Curtain gas)为25 psi，离子源温度为500 ℃，聚焦电压为265 V，去簇电压为80 V。采用Analyst QS 2.0(美国 AB Sciex 公司)数据分析系统。

1.5 LC-MS 数据处理、多变量分析以及生物标记物鉴定

图1 尿液代谢物的总离子流图( TIC)Fig.1 Total ion chromatogram of a urine sample

将通过HPLC-TOF MS方法获得的质谱数据导入MarkerViewTM1.2.1(AB Sciex) 数据分析软件，以每个样品的峰面积作为变量进行提取，所有样品通过保留时间和质荷比进行峰对齐、归一化处理，获得校正后的原始数据矩阵。对数据矩阵进行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，得到得分图(Score plot)和载荷图(Loading plot)，并从载荷图中的离散点选取差异变量离子，进一步进行结构鉴定。PCA模型的质量可以通过R2Y(拟合度)和Q2(预测性)两个参数进行评估，这两个参数值大于0.5，并且越接近1，表明PCA模型越优秀。

图2 尿液中13种常见代谢物的提取离子流图(XIC)Fig.2 Extracted ion chromatograms of 13 common metabolites in urine sample1.1-methyl adenosine(1-甲基腺苷),2.hypoxanthine nucleoside(次黄嘌呤核苷),3.cytidine(胞苷),4.histidine(组氨酸),5.phenylalanine(苯丙氨酸),6.threonine(苏氨酸),7.trypto-phan(色氨酸),8.kynurenic acid(犬尿烯酸),9.isoleucine(异亮氨酸),10.serotonin(5-羟色胺),11.gallic acid(没食子酸),12.tyrosine(酪氨酸),13.vanillic acid(香草酸)

由于以上步骤只得到差异代谢物的质荷比，并不确定其元素组成和分子式等信息，鉴定其具体结构难度较大。本研究采取以下方法进行代谢物鉴定:①找出差异代谢物离子，通过精确质量数预测可能的元素组成。②根据该代谢物的高分辨一级质谱和二级质谱数据，推断其可能的结构类型，并结合代谢物数据库(HMDB，MassBank，Metlin 和KEGG)进行结构鉴定。③对于有市售标准品的差异代谢物，通过比对标准品的保留时间、精确质量数和高分辨二级质谱，确认其最终结构。

图3 尿液代谢物的主成分分析(PCA)得分图Fig.3 Results of principal component analysis (scores plot)0 d,1 d,3 d,5 d,7 d,QC samples

2 结果与讨论

2.1 基于HPLC-TOF MS技术的尿液代谢物分析

尿液作为体内代谢物排出的主要途径，广阔覆盖了体内代谢物，尤其是水溶性和极性大的代谢物含量丰富。本研究对3种类型的色谱柱进行优化，分别比较了Agilent Eclipse XDB C8色谱柱、Agilent Eclipse XDB C18色谱柱、Waters XBridge C8色谱柱的效果，最后选择分离效果最好的Waters XBridge C8色谱柱，可在较高的流速下实现对内源性代谢物高响应强度的分析。图1为优化色谱和质谱条件后对农药暴露的尿液样本进行分析的总离子流图，可以看到，色谱峰均匀分布在整个洗脱过程，可检测到665个色谱峰。图2为从正常空白尿液中提取1-甲基腺苷、次黄嘌呤核苷、胞苷、组氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、犬尿烯酸、异亮氨酸、5-羟色胺、没食子酸、酪氨酸和香草酸13种尿液中常见物质的提取离子流图(XIC)(尿液常见化合物数据查自HMDB数据库)，各离子均可提取得到，且峰形良好。因此该方法可用于对尿液中代谢物的考察。

2.2 数据模式识别分析

采用MarkerViewTM1.2.1( AB Sciex)软件以尿液质谱峰面积作为变量进行PCA。该软件内置了峰提取、峰对齐、峰归一化和保留时间校正功能，选择Pareto Scaling模式进行数据分析。从总人数为30的样本中去除分布在95%置信区间外的2个样本，再去除由于个体差异导致的喷洒农药前一天因人体个体差异不能聚集的21个样本，最后用7个样本做PCA分析。PCA得分图和相应的载荷图见图3～4。PCA分析结果表明，R2Y和Q2分别为82%和76%，表明该PCA模型有良好的拟合度和预测性，可用于数据分析。由图3可见，QC样本聚集在一小区域内，表明方法稳定性、精密度良好。喷洒农药前1 d的样本和喷洒农药后第1 d的样本有部分重叠，在喷洒农药第3 d后，各时间点的样本完全分开，无交叉和重叠，表明随着人群和农药的接触，尿液中的代谢物发生明显变化。而且随着时间的延长，尿液中代谢物的含量变化越来越大。由图4可见，大多数变量点集中在原点附近，只有少数点远离原点，正是这些点所代表的代谢物造成了不同时间点样品组间差异。确定这些差异代谢物离子的分子结构，进而有可能发现反映毒性作用的潜在生物标志物。

图4 尿液代谢物的主成分分析(PCA)载荷图(loading plot)Fig.4 Results of principal component analysis(loading plot)

2.3 生物标记物的质谱鉴定结果及相应代谢通路分析

表1 暴露于4种农药后人尿液中的代谢生物标志物

Table 1 LC-MS/MS data of the discriminated metabolites related to multiple pesticides exposure and their identification results

m/zRT(min)MolecularformulaIdentificationresultsPathwaysConcentration153079027C8H11NO2Dopamine(多巴胺)Tyrosinemetabolism(酪氨酸代谢)下调2080848131C10H12N2O3Kynurenine(犬尿素)Tryptophanmetabolism(色氨酸代谢)上调1760950137C10H12N2O5⁃Hydroxytryptamine(5⁃羟色胺)Tryptophanmetabolism(色氨酸代谢)下调181073930C9H11NO3Tyrosine(酪氨酸)Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代谢)下调204089998C11H12N2O2Tryptophan(色氨酸)Tryptophanmetabolism(色氨酸代谢)下调1250147407C2H7NO3STaurine(牛磺酸)Bileacidmetabolism(初级胆酸合成代谢)下调1310695158C4H9N3O2Creatine(肌酸)Glycine，threonine，argininemetabolism(甘氨酸、苏氨酸、精氨酸代谢)上调 179058223C9H9NO3Hippuricacid(马尿酸)Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代谢)下调

图5 HPLC-TOF MS/MS获得的m/z132.069 5 的代谢物的一级质谱图(A)和二级质谱图(B)

Fig.5 MS spectra of precursor ion(A) and product ion(B) ofm/z132.069 5 obtained by HPLC-TOF MS/MS

实验结果表明，暴露于农药混剂后农民尿液中的色氨酸水平异常低。作为神经递质5-羟色胺和褪黑激素的唯一合成前体，色氨酸的耗竭会导致大脑中的5-羟色胺和褪黑激素枯竭。由于5-羟色胺是一种有效的食欲抑制剂，该化合物的缺乏会导致暴饮暴食和肥胖[14]。在炎症条件下，色氨酸被炎症部位的淋巴组织转化为犬尿氨酸，并由原位的巨噬细胞和嗜中性粒细胞贮存起来[15]。因此可以预期，色氨酸耗竭很可能是由接触农药后产生的炎症所致。巨噬细胞通过IPO吞没色氨酸生成犬尿素,本研究中犬尿素量的升高也印证5-羟色胺水平降低的事实。5-羟色胺是一种重要的控制人的情绪、食欲和睡眠的神经递质，人的抑郁、自闭、老年痴呆与肥胖均与5-羟色胺的内在失衡有关。重型抑郁症常伴随着免疫系统的活化，“炎症性与神经变性假说”已被用于描述此种现象[16]。抑郁症和睡眠差的病人的血清中含有较低水平的色氨酸，以及炎症性的血清标志物如白介素-6和白介素-8。这一代谢通路的扰动提示混合农药污染物可能引起免疫和神经系统的损伤。

由于多巴胺是由酪氨酸及其前体物苯基丙氨酸合成的，已经证实酪氨酸和苯基丙氨酸的减少诱导多巴胺在脑中浓度减少。大脑黑体中多巴胺信号的减少是帕金森症的关键特征，并且帕金森和接触杀虫剂有关(如除草剂百草枯[17])。尽管更多种类的农药还未在这一层面上被研究，然而有报道表明，接触草甘膦的线虫的大脑中一定区域的神经系统发生了病变[18]。这个神经系统和人的黑质纹状体的多巴胺系统非常接近，而多巴胺系统与帕金森症有关[19]。

本研究还发现复合农药暴露后农民尿液中的牛磺酸含量明显降低。牛磺酸参与胆汁酸的生物合成，牛磺酸量的变化与肝毒性密切相关，经常被认为是肝受损时的尿液标志物[20]。有资料显示，影响肝脏中线粒体氧化磷酸化的因素会导致其能量代谢障碍，进而影响合成马尿酸的能力，因此马尿酸常被看作是肝能量代谢的负荷指标[21]。本研究暴露后的农民尿液中马尿酸含量显著降低，表明肝受损。肌酸是磷酸肌酸的前体物质，主要存在于肝脏中并与能量代谢关系密切。有文献证实，大鼠经四氯化碳暴露后，尿液中肌酸的含量明显升高是由于肝损伤所造成[22-23]。本研究尿液中的肌酸显著升高，提示其毒性机制可能为肝损伤导致的代谢异常。

3 结 论

本研究将LC-TOF MS 代谢谱分析应用于施药人群暴露于多种农药后尿液的代谢物分析，通过PCA对数据进行分析，得到含量随采样时间点变化的36个差异离子作为感兴趣离子，并通过精确质量数匹配、多个数据库检索和标准品对照的方法鉴定出其中8 个代谢物，分别为多巴胺、犬尿素、5-羟色胺、酪氨酸、色氨酸、牛磺酸、肌酸和马尿酸。标志物的生物功能表明复合农药可造成人的氨基酸代谢异常，以及肝脏和神经系统损伤等多种毒性效应。这些效应与4种农药通过抑制昆虫神经轴突部位的传导，麻痹害虫的神经中枢而杀死害虫的机制相一致[24]。表明人体暴露在这4种农药中会产生类似于对昆虫的毒性作用。该方法基于我国多种农药共存污染的现状，应用新技术开展对多种农药联合暴露的复合效应研究，对完善农药毒性识别机制，建立毒性风险评估方法和人类健康风险评估体系具有重要意义。

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Metabolomics Tools for Describing Complex Pesticide Exposure in Occupational Population by HPLC/Q-TOF MS

ZHANG Yan-xin1,YANG Xin1*,XIE Bing-jie2,SHE Yong-xin2,DU Peng-fei2,ZOU Pan1,JIN Fen2,JIN Mao-jun2,SHAO Hua2,WANG Shan-shan2,ZHENG Lu-fei2,WANG Jing2*

(1.School of Chemical Engineering & Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Quality Standard & Testing Technology for Agro-Product,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

Based on high performance liquid chromatography combined with time of flight mass spectrometry(HPLC-TOF MS),the metabolomics method was established to evaluate the urine samples collected from 30 farmers,an occupational exposure population in Zhouwang village,Shanxi province,P.R.China.These people were exposed to a circumstance with acetamiprid,lambda-cyhalothrin,bifenthrin acetate and methyl amino abamectin benzoate.The urine samples were detected before the exposure,and at the first day,the third day,the fifth and seventh day after the exposure. Extracting 10 common metabolites in urine and quality control samples showed that the method has high precision and reliability.Principal component analysis(PCA) score plot was used to separate the urinary metabolic profiles from the different time urine sample,and the results showed that the urine metabolic profiles before and after the exposure to pesticide were obvious different.36 different ions were found by PCA loading plot model,in which 8 ions were identified by retrieving metabolites database and identified with standard.The most statistically significant changes were observed for dopamine,serotonin,tyrosine,tryptophan,taurine and hippuric acid(downward trend),canine urea and creatine(upward trend).This work suggests that an exposure to pesticide mixtures induces metabolism disturbance.It is inferred that the pesticide mixtures could lead to tryptophan metabolism intermediates decreased,accumulation of hepatic and energy metabolism change may related with the nervous system and liver function damage.These changes of metabolites existed in nervous and liver system are consistent with the mechanism of four kinds of pesticides which could cause damage to insecticidal nervous system.

pesticide mixtures；metabolomics；high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry(HPLC-TOF MS)；biomarkers

2015-11-05；

2015-12-02

中国农业科学院科技创新工程“农业化学污染物残留检测及行为研究”创新团队资助；中国科技部基础性专项(2013FY110100)

研究报告

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.001

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2016)05-0501-07

*通讯作者：杨 鑫，博士，教授，研究方向:食品质量与安全研究，Tel:0451-86282910，E-mail:yangxin@hit.edu.cn 王 静，博士，教授，研究方向:食品安全与检测技术，Tel:010-82106568，E-mail:w-jing2001@126.com