李桂芳，何晓英，贾 晶

(西华师范大学 化学化工学院，电化学研究所，四川 南充 637002)



氯霉素在p-PTA/CS-AB/GCE修饰电极上的电化学行为及测定

李桂芳，何晓英*，贾 晶

(西华师范大学 化学化工学院，电化学研究所，四川 南充 637002)

制备了聚磷钨酸/壳聚糖-乙炔黑修饰电极(p-PTA/CS-AB/GCE)，采用循环伏安法(CV)研究了氯霉素在该修饰电极上的电化学行为。结果表明，在pH 6.0的PBS溶液中，氯霉素(CAP)在该修饰电极上出现1个还原峰，在40～400 mV/s扫速范围内，CAP的还原峰电流与扫速呈线性关系，说明CAP在修饰电极上的电化学反应过程是受吸附控制的不可逆过程。用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的CAP进行检测，在5.0×10-7～1.0×10-4mol/L浓度范围内，还原峰电流与浓度呈线性关系，检出限(S/N=3)为5.13×10-8mol/L。用该方法对氯霉素片进行检测，相对标准偏差(RSD)为1.4%,回收率为97.7%～105.1%。

氯霉素；磷钨酸；壳聚糖；乙炔黑；差分脉冲伏安法；修饰电极

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌、伤寒杆菌和沙门氏菌具有突出的抗菌活性，临床上主要用于治疗伤寒、副伤寒和敏感菌所致的严重感染。若过量使用会造成骨髓抑制、再生障碍性贫血、发育不全甚至引起皮疹、视神经炎等不良反应[1-2]。因此，氯霉素的残留问题引起了国际组织和各国政府的高度重视，我国农业部于2002年12月明文规定CAP及其盐、酯等在所有食用动物的所有可食组织中不得检出。但由于CAP价格低、抗菌性稳定，畜牧业和水产养殖业中仍不断出现违法使用CAP的现象[3]。目前，检测食品中CAP残留的主要方法有色谱法[4-5]、分光光度法[6]、离子体共振法[7]、微生物法[8]及电化学法[9-10]等。其中，电化学方法具有灵敏度高、检测快速方便等特点。

磷钨酸(Phospho-tungstic acid，PTA)是一种杂多酸，其所具有的独特的金属-氧骨架能够经历多电子传递而保持不变[11]。乙炔黑(Acetylene，AB)由于质地轻、价格低，具有较大的比表面积和较强的导电能力，在电分析领域有广阔的应用前景，但AB几乎不溶于任何溶剂，极大地限制了其应用与发展[12]。壳聚糖(Chitosan，CS)无毒无味，具有良好的生物相溶性、吸附性和成膜性，可以均匀分散乙炔黑[13]。利用磷钨酸、壳聚糖与乙炔黑的独特结构、良好的相容性和较强的导电性，将三者同时作为修饰材料，可进一步增强电极的电催化性能，提高检测灵敏度。目前尚无应用聚磷钨酸/壳聚糖-乙炔黑修饰电极(p-PTA/CS-AB/GCE)检测CAP的研究报道，因此本实验制备了p-PTA/CS-AB/GCE电极并用差分脉冲伏安法对CAP进行测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LK2005A电化学工作站(天津兰力科公司)；CHI830B电化学分析仪(上海辰华仪器公司)；pH酸度计starter 3c(上海奥豪斯仪器有限公司)；KQ-50B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

氯霉素(CAP，武汉市华顺生物技术有限公司)；磷钨酸(PTA，湘中地质实验研究所)；壳聚糖(CS，阿拉丁试剂有限公司)；乙炔黑(AB，上海试剂有限公司)；冰醋酸(重庆茂业化学试剂有限公司)；氯霉素片(成都锦华药业有限责任公司)；其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 修饰电极的制备 玻碳电极作基底电极，用0.05 μm Al2O3抛光粉在4000#的金相砂纸上打磨抛光成镜面，用水冲洗干净，依次用HNO3(1∶1)、无水乙醇、NaOH、水超声清洗5 min，取出后用水冲洗干净在室温下晾干备用。取5 mg乙炔黑，加入1 mL 1 mg/mL壳聚糖的冰醋酸中，超声分散3 h，得黑色悬浊液，准确移取6 μL黑色悬浊液，滴涂在玻碳电极表面，放在红外灯下烘干，即制得CS-AB/GCE修饰电极。将CS-AB/GCE置于含有2.0×10-4mol/L 磷钨酸的PBS(pH 7.0)溶液中，在-2.0～2.2 V电位范围内，以100 mV/s的扫速循环扫描6圈，得到p-PTA/CS-AB/GCE。

1.2.2 电化学测试 以p-PTA/CS-AB/GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-1.2～-0.2 V电位范围内，用循环伏安法(CV)研究了不同缓冲溶液及pH值、不同修饰剂配比及用量、不同电聚合圈数及扫描速率下CAP的电化学行为。优化差分脉冲伏安(DPV)参数，测定不同浓度CAP溶液的差分脉冲伏安曲线，并用该方法进行干扰实验及加标回收实验。所有实验均在室温条件下进行。

图1 不同电极在K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中的交流阻抗图Fig.1 Nyquist plots of different electrodes in K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]a.GCE，b.p-PTA/GCE，c.CS-AB/GCE，d.p-PTA/CS-AB/GCE

2 结果与讨论

2.1 交流阻抗分析

图1为GCE(a),p-PTA/GCE(b),CS-AB/GCE(c),p-PTA/CS-AB/GCE(d)在0.01 mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中的交流阻抗图。在交流阻抗图谱中，容抗弧半径越大，表明电子在电极表面的转移阻力越大[14]。由图可知，曲线a，b，c在高频部分均出现一半圆弧，与曲线a相比，曲线b和c上的容抗弧半径较小，说明电子在单独修饰电极上的传递阻力比在裸电极上小，而曲线d在所有频率范围内近似一条直线，说明在p-PTA/CS-AB/GCE上电子传递几乎不受阻力影响，这可能是由于乙炔黑具有较多的反应位点和聚磷钨酸具有独特的电子传递骨架。故本实验选用p-PTA/CS-AB/GCE对CAP进行测定。

图2 CAP在不同电极上的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms of CAP at different electrodesa.GCE，b.p-PTA/GCE，c.CS-AB/GCE，d.p-PTA/CS-AB/GCE

2.2 CAP在不同电极上的循环伏安行为

图2为不同电极GCE(a),p-PTA/GCE(b),CS-AB/GCE(c),p-PTA/CS-AB/GCE(d)在含1.0×10-4mol/L CAP的PBS溶液中的循环伏安图。由图可知，CAP在各电极上均出现1个还原峰，无对应的氧化峰，表明CAP的电化学反应是不可逆的还原过程。对比可知，CAP在p-PTA/GCE(b),CS-AB/GCE(c)上的还原峰电流比GCE(a)上的均有所增大，这可能与乙炔黑具有较大的比表面积、较强的导电能力以及聚磷钨酸具有稳定独特的金属-氧骨架有关，但CAP在p-PTA/GCE(b)上的峰电流增加不明显，在CS-AB/GCE(c)上的背景电流过大，峰形不尖锐。与前3个电极相比，CAP在p-PTA/CS-AB/GCE(d)上的峰电流增加明显且峰形尖锐，这可能是由于乙炔黑和聚磷钨酸的协同作用，提高了电极对CAP的电流响应。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 缓冲溶液及pH值的选择 采用CV法研究了PBS，B-R和HAc-NaAc缓冲液中，CAP在p-PTA/CS-AB/GCE电极上的电化学行为。实验结果表明，在PBS缓冲液中，CAP的还原峰电流最大、峰形最好。进一步考察了PBS溶液pH值在 5.0～8.5范围内对CAP电化学行为的影响。结果发现，CAP的还原峰电位随PBS溶液pH值的增大而负移，且峰电位与pH值呈线性关系，线性方程为Epc(V)=-0.516 7-0.027 4pH，r=-0.997 9，说明该过程有质子参与反应。此外，当pH 6.0时，CAP的还原峰电流最大，故选用pH 6.0的PBS溶液为缓冲体系。

2.3.2 修饰剂配比及用量的选择 考察了CS与AB的质量比(mg ∶mg)分别为0 ∶5，1 ∶1，1 ∶3，1 ∶5，1 ∶7，1 ∶9，1 ∶15，5 ∶0时对CAP电化学行为的影响。结果表明，当AB的用量过大时电流不稳定且AB易脱落，当CS用量过大时电极的导电性降低、电流减小，而当二者的质量比为1∶5时，CAP的还原峰电流最大且AB不易脱落，因此实验选择CS与AB的质量比为1 ∶5。同时还考察了不同修饰剂用量对CAP峰电流的影响，当修饰剂用量小于6 μL时，峰电流随修饰剂用量的增加而增大；当修饰剂用量大于6 μL时，峰电流随修饰剂用量的增加反而不断减小，因此选择修饰剂的最佳用量为6 μL。

图3 不同扫速下CAP在p-PTA/CS-AB/GCE上的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of CAP at p-PTA/CS-AB/GCE with different scan ratesscan rate(a-l)：40，60，80，100，120，140，180，220，260，300，350，400 mV/s;insert：linear relationship between peak currents and scan rates

2.3.3 电聚合圈数的选择 电聚合圈数直接决定修饰层的厚度，影响电极反应过程中电子的传递。考察了电聚合圈数对电极电催化性能的影响。结果表明，当电聚合圈数由1圈逐渐增至6圈时，PTA膜不断变厚，PTA与AB间形成较大的共轭体系，增加了电极表面的反应位点，CAP的还原峰电流逐渐增大；当电聚合圈数大于6圈时，可能导致PTA聚合膜过厚，增大了电子在膜中的传递阻力，使峰电流随电聚合圈数的增多而减小。故实验选择电聚合6圈制备复合修饰电极。

2.3.4 扫速的选择 图3为不同扫速下，1.0×10-4mol/L CAP在p-PTA/CS-AB/GCE电极上的CV图。由图可知，随着扫速逐渐增大，CAP的还原峰电位不断负移，还原峰电流增大，且还原峰电流与扫速呈良好的线性关系，线性回归方程为Ipc(μA)=16.306+504.52v(V/s)，r=0.999 8，表明CAP在p-PTA/CS-AB/GCE电极上的电化学反应过程受吸附控制。此外，随着扫速的增大，充电电流不断增大，但过大的充电电流会影响CAP峰电流的测定。综合考虑，选择100 mV/s为最佳扫速。

2.4 动力学参数的测定

2.4.1 转移电子数n与质子数m根据Ipc与v呈线性关系可知，CAP在p-PTA/CS-AB/GCE上的还原过程受吸附控制，对于不可逆吸附反应，由Laviron公式[15]：Ip=nFQv/(4RT)，其中Q=5.369 4 μC，Ip=106.06 μA，T=298 K，计算可得n=2.03 ≈ 2。此外，发现Epc与lnv呈线性关系，线性方程为Epc(V)=-0.755 9-0.032 6lnv(V/s)，r=-0.993 6。根据Bulter-Volmer方程[16]：Epc=E0-[RT/(βnF)]ln[RTKs/(βnFv)]，由直线斜率RT/(βnF)=0.032 6可知，T=298 K时，电荷的传递系数β=0.393 3。根据公式[17]dE/dpH=RTm/(βnF)，计算得参与反应的质子数为1。

2.4.2 电极有效面积A以p-PTA/CS-AB/GCE为工作电极，对1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]与0.1 mol/L KCl混合溶液进行循环伏安测定，以Ipc对v1/2作图，得Ipc与v1/2的线性关系式：Ipc(μA)=-7.324 5+133.48v1/2，r=0.999 8。根据Randles-Sevcik方程[18]：Ipc=2.69×105n3/2AD01/2v1/2C0，计算得电极的有效面积(A)为0.063 6 cm2。

2.4.3 扩散系数D以p-PTA/CS-AB/GCE为工作电极，对1.0×10-4mol/L CAP的PBS溶液进行计时电量测定。在Q～t曲线上均匀取点，根据数据作Q～t1/2图，其线性方程为：Q(μC)=1.927 2+12.847 3t1/2，r=0.996 4。根据Cottell方程[19]：Q=(2nFAD1/2C0t1/2)/π1/2+Qdl+nFAΓ0。在已知有效面积A的情况下，根据方程斜率，可计算出CAP在pH 6.0的PBS溶液中的扩散系数D为 2.428 8×10-4cm2/s。

2.4.4 CAP在p-PTA/CS-AB/GCE上的吸附量Г 采用CV法对1.0×10-4mol/L CAP的PBS溶液进行测定，根据Laviron公式[20]：Ip=n2F2ГAv/(4RT)，其中R，F，T具有通常意义，n是转移电子数，v是扫描速率，A是电极有效面积，Г是反应物吸附量。当扫速为100 mV/s时，计算可得CAP在p-PTA/CS-AB/GCE表面的吸附量(Г)为6.805 6×10-9mol/cm2。

2.5 差分脉冲伏安测定

2.5.1 差分脉冲伏安测定参数的优化 采用差分脉冲伏安法对CAP进行测定，为了提高检测灵敏度，对差分脉冲伏安测定参数进行了优化，最佳的实验参数为：电位增量0.008 V，脉冲幅度0.1 V，脉冲宽度0.07 s，脉冲间隔1.5 s，等待时间1 s。

图4 不同浓度CAP在p-PTA/CS-AB/GCE上的差分脉冲伏安图Fig.4 Differential pulse voltammograms of different concen-trations of CAP at p-PTA/CS-AB/GCEconcentration of CAP(a-i)：0.5，7.0，10，20，40，55，70，85，100 μmol/L；insert：linear relationship between peak currents and concentrations

2.5.2 CAP在p-PTA/CS-AB/GCE上的差分脉冲伏安行为 在最佳测定条件下，不同浓度CAP在p-PTA/CS-AB/GCE上的差分脉冲伏安图见图4。结果表明，还原峰电流随CAP浓度的增大而增大，且在5.0×10-7～1.0×10-4mol/L浓度范围内，还原峰电流与浓度呈良好的线性关系，线性方程为Ipc(μA)=44.659+0.976 7c(μmol/L)，r=0.996 5。检出限(S/N=3)为5.13×10-8mol/L。用同一支修饰电极对1.0×10-4mol/L CAP平行测定7次，相对标准偏差(RSD)为2.1%。用新制备的p-PTA/CS-AB/GCE修饰电极对CAP进行测定，放置10 d后，再次对CAP进行测定，还原峰电流仅下降5.3%，说明该电极有良好的重现性和稳定性。比较本方法和其他修饰电极的检测结果(表1)可知，本修饰电极具有更好的稳定性和更高的检测灵敏度。

表1 各种检测氯霉素方法的比较

Table 1 Comparison of different mothods for determination of CAP

ModifiedelectrodeLinearrange(mol/L)Detectionlimit(mol/L)StabilityMothodReferenceAu-TiO2/GCE80×10-7～10×10-478×10-899%CA[1]PARSE/GCE38×10-4～46×10-350×10-6-CV[10]Pt/GCE10×10-5～10×10-350×10-6-LSV[21]GCE/Nafion-Ag50×10-7～30×10-410×10-7-DPV[22]ERGNO-ZnO/GCE10×10-7～10×10-367×10-888%DPV[23]p⁃PTA/CS-AB/GCE50×10-7～10×10-4513×10-853%DPVThiswork

2.5.4 实际样品的检测 将一片氯霉素(0.25 g/片)在研钵中研碎，用乙醇完全溶解后定容于50 mL容量瓶中，移取上述溶液1 mL稀释至100 mL，储存在冰箱中备用。准确取1 mL该溶液加入9 mL PBS缓冲溶液(pH 6.0)中，在优化实验条件下，用DPV法进行检测，测得氯霉素片样品中CAP的含量为0.245 g/片，RSD为1.4%。同时进行样品加标回收实验，回收率为97.7%～105.1%(表2)。

表2 氯霉素片中CAP的检测及回收率实验

Table 2 Determination of CAP in chloramphenicol tablets sample and its recovery test

OriginalcO/(×10-5mol/L)AddedcA/(×10-5mol/L)FoundcF/(×10-5mol/L)AveragefoundcF/(×10-5mol/L)RSDsr/%RecoveryR/%153820003471，3542，3495350310977155125004071，4214，41044130181051146330004432，4536，45724513161034

3 结 论

本文通过电聚合法和滴涂法制备了p-PTA/CS-AB/GCE修饰电极，在该修饰电极上，CAP于-0.68 V处出现1个不可逆还原峰。采用DPV法测定不同浓度的CAP，其还原峰电流与浓度在5.0×10-7～1.0×10-4mol/L范围内呈良好线性关系，检出限为5.13×10-8mol/L。该修饰电极表现出较好的稳定性和重现性，具有较强的抗干扰性，可用于药物中CAP的常规检测。

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Determination of Chloramphenicol at Poly Phospho-tungstic Acid/Chitosan-Acetylene Black Modified Electrode and Its Electrochemical Behaviors

LI Gui-fang,HE Xiao-ying*,JIA Jing

(Institute of Electrochemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering，China West Normal University，Nanchong 637002,China)

A new modified electrode(p-PTA/CS-AB/GCE) was prepared with phospho-tungstic acid,chitosan and acetylene black.The electrochemical behaviors of chloramphenicol(CAP) on p-PTA/CS-AB/GCE were investigated by cyclic voltammetry(CV).The results showed that there was an obvious reduction peak of CAP on the modified electrode in pH 6.0 PBS buffer solution and the reduction peak current was linear to the scan rate in the range of 40-400 mV/s,indicating that the electrode process of CAP was controlled by absorption.The different concentrations of CAP were determined by differential pulse voltammetry,and a good linear relationship was observed between reduction peak current and CAP concentration in the range of 5.0×10-7-1.0×10-4mol/L.The detection limit(S/N=3) was 5.13 ×10-8mol/L.The mothed was applied in the determination of CAP in chloramphenicol tablet sample,with relative standard deviation of 1.4%and recoveries of 97.7%-105.1%.

chloramphenicol;phospho-tungstic acid;chitosan;acetylene black;differential pulse voltammetry；modified electrode

2015-09-04；

2015-12-14

四川省高校科技创新团队建设项目(2010008)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.011

O657.1;R978.1

A

1004-4957(2016)05-0563-06

*通讯作者：何晓英，教授，研究方向：电化学研究，Tel：0817-2185612，E-mail：hexysctc@aliyun.com