罗维玉，朱鹏阳，张 杰，胡永浩，孔晖晖，梁立滨，周 圆，李呈军，姜 丽，陈化兰



人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP 互作宿主蛋白的筛选

罗维玉1,2，朱鹏阳2，张 杰2，胡永浩1，孔晖晖2，梁立滨2，周 圆2，李呈军2，姜 丽2，陈化兰1,2

（1甘肃农业大学动物医学院，兰州730070；2中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，哈尔滨150001）

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子，为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA，混合后反转录生成cDNA，利用长距离PCR（LD-PCR）扩增合成dscDNA，用CHROMA SPINTM+TE-400 纯化柱纯化dsDNA，按照Clontech公司的Make Your Own“Mate &Plate”Library System操作程序，将带有同源臂的dscDNA与线性化pGADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞，涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右，收集所有菌落，混匀分装即为Calu-3和A549 细胞cDNA的酵母文库，并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用RⅠ和HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005（H5N1）NP定向插入pGBKT7载体，构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒pGBKT7-NP，经验证该质粒无自激活活性，并进一步采用构建完成的Calu-3/A549 细胞酵母文库进行杂交筛选，筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌，分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照，挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α -gal/AroA(SD/-4/X/A) 固体培养板上生长良好且变蓝的菌落，即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白，提取酵母质粒，进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰，5S条带暗淡，表明所提RNA质量较高，基本无降解；对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA，dscDNA条带呈弥散状，片段大小分布于500—2 000bp之间，说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录；……