武静莲，徐 强，谢亲建，白泽明，韩金萍，李晓芳，方晓霞

1甘肃省第三人民医院，甘肃 兰州730020；2武警甘肃省总队医院；3武威市人民医院

党参抗肿瘤药理作用研究

武静莲1，徐 强2，谢亲建2，白泽明3，韩金萍2，李晓芳3，方晓霞2

1甘肃省第三人民医院，甘肃 兰州730020；2武警甘肃省总队医院；3武威市人民医院

目的：探讨党参多糖对肝癌细胞的活性。方法：M TT法探索党参多糖对肝癌细胞的抑制作用，利用荧光显微镜检测党参多糖对肝癌细胞的凋亡作用、瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学、病理切片及急性毒性确定党参多糖毒性。结果：党参多糖对肝癌细胞SM M C-7721细胞具有抑制作用，细胞核固缩，有凋亡小体的出现，但是党参多糖对昆明种小鼠的脏器没有明显的毒性。结论：党参多糖具有抑制肝癌细胞SM M C-7721的作用。

党参；肝癌细胞株；抗肿瘤

甘肃是全国中药材种植基地，中药材的有效成分含量高，特别适宜党参、黄芪、当归等药材的种植。党参含有多糖、酚类、甾醇、挥发油、皂苷及微量生物碱等成分，它具有抗溃疡、调整胃肠功能、强心、抗休克、增强造血的功能［1-3］。此外，研究发现党参多糖具有抗肿瘤的作用［4-5］。近年来，笔者通过药理实验，发现党参多糖能够抑制肝癌细胞SMMC-7721，且在抑制剂量范围内，党参多糖对小鼠的脏器没有损伤，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 党参购买于兰州市黄河市场，产地：甘肃岷县。经兰州大学药学教研室马志刚教授鉴定正品；SPF级昆明种小鼠，购自兰州大学实验动物中心，体质量(20±2)g，50只，3周龄，l8～20 g，雌雄各半。

1.2 仪器 SARTORIUS-BT23S分析天平 (北京赛多利斯有限责任公司提供)，KH-5200B超声清洗器(昆山禾木超声仪器有限公司提供)，UV722S紫外分光光度计、thermo CO2培养箱(美国赛默飞公司提供)，Multiskan Spectrum酶标仪(美国赛默飞公司提供)。

1.3 试剂 小牛血清(四季青)，DMEM培养基(美国GIBCO公司提供)，SMMC-7721细胞株(甘肃省武威市人民医院提供)。

1.4 方法

1.4.1 党参多糖的制备方法 1)称量党参80 g，除去杂质和霉变药物，清水冲洗、晒干；2)切碎，将党参切成2～4 cm的段放入煮缸煎煮，加入纯水7～10倍，煎煮2～3次，每次2～3小时，过滤，合并滤液，滤渣干燥处理后即得饲料；3)浓缩、合并的滤液减压浓缩至半流体，比重为1.25～1.26，温度为70～80℃，放置冷却；4)离心分离：将放置冷却的浓缩液，离心分离得沉淀物和母液，而沉淀物用纯水洗2次，每次加纯水按沉淀物湿重的1/3～1/4，搅匀，离心分离，于60～80℃干燥，得黄色粉末状沉淀物即党参多糖提取物，党参多糖含量60%以上；5)母液处理：合并3次分离所得母液，浓缩比重为1.25～1.26，温度在70～80℃，党参多糖含量2%以上；最后合并党参多糖的浓缩液，混合均匀［3-9］。

1.4.2 M TT的方法 取肝癌细胞对数生长期的细胞［10-13］，计数、稀释，最终细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板上，每孔加100 μL的细胞，接种24小时后，按照给药剂量分为4、2、1、0.5、0.25 mg/mL共5组，培养24小时加药，每孔加20 μL，每组设4个平行孔，空白组加培养液，培养48小时后，加入MTT和DMSO检测，按以下公式计算：

抑制率=(正常对照组 -给药组)／正常对照组

1.4.3 细胞核固缩的观察 取肝癌细胞对数生长期的细胞，计数、稀释，最终细胞密度为1×105个/mL，接种于6孔板上，每空加3 mL的细胞，接种24小时候，按照给药剂量分1 200、600、300 μg/mL共3组，在培养24小时，每孔分别加300 μL的药，空白组加等体积培养液，培养24小时后，收集细胞，用PBS洗涤1～2遍，用多聚甲醛固定15分钟后，染色，当染色液吹干后，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察［14-15］。

1.4.4 细胞形态学的观察 2.5×106细胞经同一时间不同浓度或同一浓度不同时间的党参多糖混悬液培养后收集，对照组加入最高党参多糖剂量组药量等体积的溶剂。PBS洗2遍，取少量细胞离心涂片，瑞氏-吉姆萨染色，光镜下观察形态。

1.4.5 病理切片的观察 用昆明种小鼠做党参多糖的急性毒性实验［14-15］，先用20只小鼠做急性毒性的预实验，然后把小鼠分成4组，分别为高、中、低剂量组和对照组，每组10只。2周以后，用断头法处死小鼠，用病理观察方法观察小鼠心、肝、肺。

1.4.6 小鼠急性毒性实验 根据预实验，取禁食不禁水12小时的小鼠150只，雌雄各半，体质量(20±2)g，平均分成15组给药实验，分别采用单次静脉注射给药法，腹腔注射给药法，灌胃给药法测定各受试药对小鼠产生的急性毒性，药物质量浓度最大为1 200 μg/mL，然后按1∶0.8依次稀释作为其他组的浓度，按小鼠体质量计算，注射体积分别为0.6、0.4、0.15 mL，全部药量在45s内注完，给药后立即观察各组动物反应情况，连续观察2周，记录小鼠体质量变化和中毒情况，按照改良寇氏综合计算法的要求，根据公式：LD50=lg-1［lgDm-lgr(∑P-0.5)］计算党参多糖溶液的半数致死量。

2 结果

2.1 党参多糖体外肝癌的抑制率及对肝癌细胞核的影响 党参多糖对肝癌细胞株SMMC-7721有抑制作用，并且随着药物浓度的增大，抑制率增大，特别是4 mg/mL时，抑制率达到了69.2%。见图1。低剂量组出现核固缩，细胞核的形状变形，凋亡小体不明显；高剂量组凋亡小体明显，而且出现大量的凋亡小体，细胞核固缩也十分明显。见图2。

图1 党参多糖对肝癌细胞的抑制率图

图2 药物对肝癌细胞核的影响 H oechst 33258×200

2.2 细胞形态学观察结果 光学显微镜下观察对照组细胞分布均匀，大小一致，见图3-A。加入600 μg/mL的RPMI1640作用细胞12小时，可见细胞无变化。加入300 μg/mL的党参多糖体积缩小，细胞不规则，细胞膜周边有的形成小泡，正处于形成凋亡小体的过程中，见图3-B。加入600μg/mL的党参多糖体积缩小，细胞连接紧密不规则，细胞膜周边有的形成小泡，正处于形成凋亡小体的过程中，见图3-C。1 200 μg/mL的党参多糖作用于SMMC-7721细胞12小时，可见细胞在形态上的变化，见图3-D。为了进一步观察细胞核的形态变化，我们采用Hoechst 33258荧光染色法。正常细胞发出均匀的荧光，见图3-A、B。1 200 μg/mL的党参多糖作用于细胞12小时后，凋亡细胞核皱缩，荧光变得致密，可见明显的粒状荧光体聚集，为凋亡小体。

图3 细胞形态学观察结果 H E×200

2.3 党参多糖对小鼠脏器的影响 小鼠给药7天后，党参多糖提取液低浓度组心肌纤维排列整齐有序，未见断裂、变性及坏死，见图4-A。其余几组党参多糖提取液组均见心肌纤维断裂溶解，有炎性细胞浸润，大量出血，见图4-B、C、D、E。原料组心肌纤维断裂溶解，有炎性细胞浸润，大量出血，见图4-F。

图4 党参多糖对小鼠心脏的影响 H E×400

2.4 党参多糖对昆明种小鼠的急性毒性结果 本实验利用3种不同的给药方式对党参多糖溶液进行比较，其实验结果见表1-3。

表1 小鼠腹腔注射(i p)党参多糖溶液急性毒性的实验结果

表2 小鼠灌胃(i g)党参多糖溶液急性毒性的实验结果

表3 小鼠静脉注射(i v)雄黄浸出液急性毒性的实验结果

3 讨论

近年来，中药的研究越来越多，中药治疗疾病的范围越来越广泛，特别是治疗癌症方面。笔者对党参的主要活性成份党参多糖和皂苷进行了研究，结果表明党参多糖确实具有抗癌的作用，且对小鼠脏器的损伤不大，说明党参多糖的毒性小，药理活性强，是治疗癌症的有效中药成分。本研究通过形态学研究进一步证实了党参多糖的抗癌作用。但对于党参多糖抗癌的机制还不清楚，有待于进一步研究。

［1］ 杨瑾，袁德培，陈龙全，等.党参多糖类成分抗肿瘤活性的研究进展［J］.湖北民族学院学报：医学版，2011，28(3)：67-68．

［2］ 宁理文，赵红新.党参的药理作用及临床应用［J］.临床合理用药，2014，7(10)：66-67.

［3］ 张承军，王建良，李川国，等.甘肃产党参中党参炔苷含量的动态研究［J］.2014，27(9)：7-9.

［4］ 杨瑾，董兴高，袁德培，等.板桥党参多糖抗肿瘤活性实验研究［J］.湖北民族学院学报：医学版，2014，31(1)：6-8.

［5］ 丁莉，田先翔，吴勇，等.板桥党参对肠黏膜损伤修复的作用［J］.西部中医药，2014，27(11)：11-13.

［6］ 金黎明，刘李娜，许永斌，等.硒化党参多糖的制备及其抗氧化性能研究［J］.大连民族学院学报，2014，16(1)：10-13.

［7］ 张新宇，王雷，李光友，等.绿色巴夫藻硒多糖的提取分离与纯化［J］.海洋与湖沼，2000，31(6)：643-646.

［8］ 唐家骏，苗海风.硒花角叉菜胶的制备及其理化性质和生化活性研究［J］.生物化学与生物物理学报，1988，20(3)：259-261.

［9］ 何子双.党参黄芪提取物防治猪热应激［J］.中兽医学杂志，2014（5）：55-57.

［10］王娟锐，王建刚，李艳.纯化雄黄体内外抗肿瘤作用［J］.中国新药杂志，2008，17(12)：1030-1033.

［11］D ongzhu D uan，Baoxi n Zhang，Juan Y ao，etal.G am bogi c aci d i nduces apopt osi s i n hepat ocel l ul ar carci nom a SM M C-7721 cel l s by t arget i ng cyt osol i c t hi oredoxi n reduct ase［J］.Free Radi calBi ol ogy and M edi ci ne，2014，69（8）：15-25.

［12］X i e Q J，Cao X L，BaiL，etal.A nt i-t um oreffect sand apopt osi si nduct i on by real garbi ol eachi ng sol ut i on i n Sarcom a-180 cel l s i n vi t ro and t ranspl anted t um ors i n m i ce i n vi vo［J］.A si an Pac J Cancer P，2014，15（4）：2883-2888.

［13］Zhang X，X i e Q J，W ang X，etal.Bi ol ogi calext ract i on of real gar by aci d i t hi obaci l l us ferroxi dase and i t s i n vi t ro and i n vi vo ant i t um or act i vi t i es［J］.Pharm Bi ol，2010，48（7）：40-47.

［14］马方励，沈雪梅，时军.党参多糖对实验动物胃肠道功能的影响［J］.安徽医药，2014，18(9)：1626-1629.

［15］谢亲建，张旭，王欣，等.雄黄微生物浸出液对S180腹水瘤的生长抑制效应及其毒性研究［J］.中药材，2009，32(6)：933-936.

Study on Antitwnor Effects of Dangshen

WU Jinglian1,XU Qiang2,XIE Qinjian2,BAI Zeming3,HAN Jinping2,LI Xiaofang3,FANG Xiaoxia2
1 The Third People's Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730020,China;
2 Gansu Armed Police Hosipital;3 Wuwei People's Hospital

Objective:To investigate the activity of polysaceharides on liver cancer cells.Methods:MTT method was used to study the inhibition effect of codonopsis pilosula polysaccharide on liver cancer cells.The apoptosis effect of codonopsis pilosula polysaccharide on liver cancer cells was examined through Fluorescence microscopy. Codonopsis polysaccharide toxicity was determined through cells morphology observed by Wright's-Giemsa staining, pathological section and acute toxicity experiment.Results:Codonopsis pilosula polysaccharide had inhibition effect on hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721 which could induce nucleus pyknosis and the appearance of apoptotic bodies.But codonopsis pilosula polysaccharide had little cytotoxic effect on organs of Kunming mice.Conclusion: Codonopsis pilosula polysaccharide has inhibition effect on hepatocellular carcinoma cell SMMC-7721.

Dangshen;hepatocellular carcinoma cell line;antitumor effect

R285.5

A

1004-6852(2016)08-0018-04

2016-03-09

武静莲(1970—)，女，副主任药师。研究方向：中药药理学。