马新换，郭 敏，乔 莉，肖正国

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

甘肃不同地域伏毛铁棒锤中乌头碱及3-乙酰乌头碱的含量分析*

马新换，郭 敏，乔 莉，肖正国

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

目的：分析甘肃不同地域伏毛铁棒锤中乌头碱及3-乙酰乌头碱的含量差异。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为 G em i ni-N x-C18柱(5 μm，4.6 m m×250mm)，以乙腈：0.2%碳酸氢铵溶液(55:45)为流动相，流速为1.0 m L/m i n，检测波长230 nm，柱温：30℃进行检测。结果：乌头碱线性范围为：19.20～57.55 μg/m L，平均加样回收率为101.30%，(RSD=2.34%)；3-乙酰乌头碱线性范围为：4.8～50 μg/m L，平均加样回收率为100.67% (RSD=0.77%)。结论：该法快速、简便，结果准确、可靠，可用于伏毛铁棒锤中乌头碱及3-乙酰乌头碱的含量测定及差异分析。

伏毛铁棒锤；甘肃；乌头碱；3-乙酰乌头碱；含量分析

伏毛铁棒锤为毛茛科乌头属植物(Aconitum f lavum Hand.-Mazz.)的干燥块根，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药(第一册)［1］。伏毛铁棒锤为藏族习用药材，在我省分布广泛，具有祛风除湿、消肿止痛、散瘀的功效，主要用于风湿性关节炎、关节痛、跌打瘀痛、毒热、肿瘤等疾病的治疗。现代药理研究表明［2-4］：伏毛铁棒锤的有效成分为乌头生物碱类，其生物碱具有较强的镇痛、抗炎、局麻、解热及致心律失常作用，其中乌头碱、3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱为铁棒锤的主要有效成分，是其药理作用的基础。本研究通过RP-HPLC法测定甘肃四个地域伏毛铁棒锤中乌头碱、3-乙酰乌头碱的含量，考察有效成分与地域的相关性，为伏毛铁棒锤药材的质量控制和临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 2695高效液相色谱仪，包括2998PDA紫外检测器，2695中文色谱工作站；2695自动进样器。

1.2 试药 伏毛铁棒锤药材由甘肃省甘南藏医药研究院提供，乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号：110798-200805，供含量测定用)，3-乙酰乌头碱对照品(上海佰世凯化学科技有限公司提供，CAS：77181-26-1，含量达到98%以上)，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂为分析纯。

1.3 方法［5-12］

1.3.1 色谱条件 色谱柱：色谱柱Gemini-Nx-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：0.2%碳酸氢铵溶液(55:45)；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。理论板数按乌头碱计算，应不得低于4 000。在此色谱条件下，样品分离良好，乌头碱(A)色谱峰保留时间tR=9.8分钟，3-乙酰乌头碱(B)色谱峰保留时间tR=31.6分钟，HPLC图谱见图1。

图1 对照品及样品H PLC色谱图

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的乌头碱对照品8 mg、3-乙酰乌头碱对照品2 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解、定容至刻度，摇匀，得到乌头碱对照品溶液浓度为800 μg/mL，3-乙酰乌头碱对照品溶液浓度为200 μg/mL，备用。

1.3.3 混合对照品溶液的制备 分别精密吸取乌头碱对照品溶液和3-乙酰乌头碱对照品溶液各3 mL，混合于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。进样前用C18色谱预柱过滤。

1.3.4 供试品溶液的制备 取伏毛铁棒锤药材粉碎成粗粉，取约2.50 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加100 mL甲醇，加热回流提取2小时，滤过，滤液体积浓缩至20 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2 结果

2.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，按“1.3.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰。以各成分吸收度(A)为纵坐标，以对照品浓度(C，μg/mL)为横坐标，进行线性回归，得到回归方程，乌头碱线性回归方程：A=0.000 21C+0.001 74，r=0.999 0，线性范围为：19.20～57.55 μg/mL；3-乙酰乌头碱线性回归方程：A=0.000 55C-0.009 2，r=0.998 5，线性范围为：4.8～50 μg/mL。

2.2 精密度实验 精密移取同一浓度的混合对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，测定峰面积值，结果乌头碱峰面积的RSD为0.88%，3-乙酰乌头碱峰面积的RSD为1.22%。表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验 精密移取同一浓度的混合对照品溶液，分别于0、3、5、6、7小时进样测定峰面积值，结果乌头碱峰面积的RSD为0.97%，3-乙酰乌头碱峰面积的RSD为1.11%，结果表明，样品溶液在7小时内稳定，可以进行含量测定。

2.4 重现性实验 取甘肃临夏同一批伏毛铁棒锤药材适量，按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，测定峰面积值，结果乌头碱和3-乙酰乌头碱的平均含量分别为 210.08 mg/g、22.02 mg/g，RSD分别为2.23%和1.97%结果表明，方法重现性良好。

2.5 回收率实验 取已知乌头碱和3-乙酰乌头碱含量的伏毛铁棒锤药材12份，每份约2.50 g，等分为2组，精密称定，分别精密加入适量的乌头碱对照品和3-乙酰乌头碱对照品，按“1.3.4”项下制备方法平行制备，按“1.3.1”项下色谱条件测定，结果见表1。乌头碱的平均加样回收率为101.30%，RSD%=2.34%；3-乙酰乌头碱的平均加样回收率为100.67%，RSD%=0.77%。表明实验方法准确，见表1。

2.6 样品测定 取各产地伏毛铁棒锤药材，按“1.3.4”项下方法制备，按“1.3.1”项下色谱条件测定，按外标一点法计算含量，结果见表2。

表1 伏毛铁棒锤中乌头碱和3-乙酰乌头碱回收率实验

表2 不同产地伏毛铁棒锤中乌头碱及3-乙酰乌头碱含量测定结果(n=6)m g/g

3 讨论

检测波长的选择：本实验同时测定了伏毛铁棒锤中乌头碱及3-乙酰乌头碱两种生物碱成分的含量，在波长254、230、280 nm下进行扫描，结果230 nm下两种成分分离完全，峰形较好，最终选择230 nm作为检测波长。由上图结果可以看出：伏毛铁棒锤中乌头碱和3-乙酰乌头碱的含量呈地域相关性，在各单个生物碱及总生物碱含量中，临夏最高，天水次之，武威最低。此实验数据的获得，为以后药物应用提供参考。

［1］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(藏药)［M］.北京：人民卫生出版社，1995：79.

［2］ 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1979：318-319.

［3］ 孙文基，沙振方，王艾兴，等.铁棒锤化学成分研究［J］.药学学报，1989，24(1)：71-74.

［4］ 李宏刚，杨建萍.伏毛铁棒锤地上部分生物碱成分研究［J］.中草药，1997，28(5)：265-266.

［5］ 张帆，彭树林，白冰如，等.伏毛铁棒锤根中总生物碱的串联质谱分析［J］.质谱学报，2006，27(2)：71-73.

［6］ 罗达尚.中华藏本草［M］.北京：民族出版社，1997：63.

［7］ 胡本祥，李华，王宇鹏.铁棒锤的生药研究［J］.中国中医药信息杂志，2003，10(增刊)：20-21.

［8］ 王毓杰，张静，田会萍，等.民族药铁棒锤炮制减毒原理初步研究［J］.中国中药杂志，2010，35(5)：588-592.

［9］ 汪付田，展锐，王建良，等.铁棒锤快速繁殖体系的建立［J］.中草药，2012，43(6)：1191-1194.

［10］顾洁，王俊，王鸿，等.伏毛铁棒锤不同器官生物碱含量动态变化研究［J］.西北植物学报，2010，30(1)：170-174.

［11］王毓杰，曾陈娟，姚喆，等.民族药铁棒锤不同药用部位中生物碱含量测定［J］.中成药，2010，32(8)：1390-1393.

［12］赵英永，崔秀明，戴云，等.高效液相色谱法测定草乌类药用植物活性成分含量［J］.中国药学杂志，2007，42(11)：815-818.

Content Analysis of Aconitine and 3-Acetyla Conitine in TuMao TieBangChui in Different Areas of Gansu Province

MA Xinhuan，GUO Min，QIAO Li，XIAO Zhengguo
Gansu Provincial Hospital of traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective:To analyze the content difference of aconitine and 3-Acetyla conitine in FuMao TieBangChui(aconitum flavum Hand.-Mazz)in different areas of Gansu Province.Methods:High performance liquid chromatography was used on Gemini-Nx-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)chromatographic column with acetonitrile, 0.2%ammonium bicarbonate solution(55:45)as mobile phase at the detection wavelength of 230 nm with the flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature was 25℃.Results:Linearity range of aconitine was 19.20～57.55 μg/mL while average recovery was 101.30%(RSD=2.34%);Linearity range of 3-Acetyla conitine was 4.8～50 μg/mL while average recovery was 100.67%(RSD=0.77%).Conclusion:The method is fast and handy while the result is accurate and reliable.It can be used in the determination of content and variation analysis on aconitine and 3-Acetyla conitine in FuMao TieBangChui.

FuMao TieBangChui;Gansu;aconitine;3-Acetyla conitine;content analysis

R282.6

A

1004-6852(2016)08-0015-03

2016-03-17

甘肃省中医药管理局项目(编号G ZK-2014-9)。

马新换(1976—)，男，高级工程师。研究方向：药物制剂研发及质量控制。