李文哲，丁清华，罗立娜，范金霞，李鹏飞，王金秋

（东北农业大学大学工程学院，哈尔滨 150030）

接种菌剂对稻秸好氧厌氧两相发酵产气影响

李文哲，丁清华，罗立娜，范金霞，李鹏飞，王金秋

（东北农业大学大学工程学院，哈尔滨 150030）

为提高水稻秸秆在好氧厌氧两相发酵工艺中降解率，采用好氧水解阶段添加不同菌剂方法提高好氧产酸相纤维素降解率。结果表明，各处理组中木霉和黑曲霉混菌组较单一菌种组纤维素和半纤维素降解率更高，水解效果更好。其中木霉黑曲霉混菌曝气组，总酶活最高，纤维素和半纤维素降解效果最好，累积产甲烷量最高，TS产气量最高达到438.57 mL·g-1。由此可见，木霉、黑曲霉混菌并同时曝气供气方式能显著提高水稻秸秆固体有机物降解利用率，促进秸秆生物质转化为沼气。

木霉；黑曲霉；纤维素降解；酶活；产气特性

李文哲,丁清华,罗立娜,等.接种菌剂对稻秸好氧厌氧两相发酵产气影响[J].东北农业大学学报,2016,47(5):98-105.

Li Wenzhe,Ding Qinghua,Luo Lina,et al.Effect of microbial inoculants on combined aerobic and anaerobic two-phase fermentation of rice straw for biogas production[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(5):98-105.(in Chinese with English abstract)

我国作为农业大国，农业废弃物量日益增加，其中水稻秸秆约占24%，大部分被废弃或者焚烧，给环境造成严重影响[1]。水稻秸秆作为植物光合作用产物[2]，含有蛋白质、脂肪、纤维素、半纤维素、木质素及灰分等物质，是宝贵可再生资源，发酵沼气可解决能源和环境双重问题，受到广泛关注。但水稻秸秆中木质素含量较高，对纤维素形成强烈屏障作用[3-5]，阻碍水稻秸秆厌氧发酵。研究表明木质素最初裂解需分子氧存在[6-7]，因此好氧水解和厌氧产甲烷两相结合发酵方式可提高水稻秸秆产沼气量。可采用物理法、化学法和生物法等打破木质素屏障提高好氧水解阶段木质纤维素降解率。但物理法能耗大，设备成本高[8-13]；化学法易造成二次污染[14-15]；生物法环保无污染、成本低、使用条件温和[16]。目前国内外主要利用纯培养单菌或复合菌群对秸秆预处理。杨玉楠等利用白腐菌中典型菌种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete Chrysosporium）生物预处理稻草，结果表明室温下白腐菌预处理20 d、厌氧发酵15 d，甲烷转化率为47.63%，继续发酵至30 d，甲烷转化率高达58.74%[17]；王伟东等利用复合菌系BYND-8在30℃对稻草秸秆预处理10 d，结果表明预处理后秸秆厌氧发酵累积产气量提高44.5%，产气高峰提前8 d[18]；王宏勋等研究白腐菌株CD1对稻草秸秆中木质纤维素降解规律，结果表明，降解特性良好，对木质素降解率可达到65%以上[19]。VMehta等发现，经P.florida转化后稻草基质用于沼气发酵生产时，纤维素酶释放能力提高4.3倍[20]。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻秸秆取自东北农业大学香坊实验实习基地，风干后将水稻秸秆剪成2～3 cm小段，取样测定基本指标，剩余部分待用。接种物取自实验室沼气发酵中试系统厌氧发酵后沼液。木霉和黑曲霉均来自东北农业大学沼气发酵实验室。黑曲霉和木霉所用为PDA培养基。原料和接种物基本特性如表1所示。

1.2 方法

试验采用有效容积2 500 mL广口瓶为反应容器，试验温度为中温37℃，排水法收集产生气体测量气体体积，集气袋采集气体，测量气体成分。

试验分为曝气组、搅拌组、对照组3组，其中每组包括3个处理组即添加木霉、添加黑曲霉、添加木霉和黑曲霉混菌处理组，每处理组设2个平行。每处理组菌种添加量为好氧水解样品总质量1%，即每处理组加入13 mL处于对数生长期菌悬液，木霉和黑曲霉混菌按质量比1 ϑ 1添加。试验过程中，曝气频率为2 min·h-1，搅拌频率为2 min·h-1，对照组敞口，无额外供气。好氧水解阶段按照总TS为10%配料，每4 h监测一次pH。水解24 h后厌氧发酵，添加沼液调节TS为8%，每天2次手动摇匀发酵液，每24 h测1次气体产量和成分，直至试验结束。试验方案如表2所示。本文所得数据均为扣除沼液空白组数据。

表1 原料和接种物基本特性Table 1Basic properties of fermentation raw materials

1.3 指标测定

TS采用（105±5）℃烘箱恒温干燥法测量；VS采用550～600℃马弗炉灼烧法测定；pH采用上海雷磁酸度计测定；总氮测定将样品经380℃，2 h消解后采用Kjeltec2300凯式定氮仪测定；氨氮测定直接将液样离心后去5 mL上清液，用Kjeltec 2300凯式定氮仪测定；气体成分采用安捷伦6890型气相色谱测定，柱型号TDX-01，柱温150℃，总流量40.0 mL·min-1，运行时间2 min，TCD检测器，温度为220℃，氮气为尾吹气，氩气为载气，进样口温度为室温，外标法测定气体成分及含量，标准曲线包含5个浓度甲烷含量，范围为9.85%～80.3%；纤维素、半纤维素、木质素采用ANKOM 200i半自动纤维分析仪测定。

表2 试验方案Table 2Experiment scheme

酶活测定方法：发酵液5 000 r·min-1，离心5 min后，取上清液，得到粗酶液。分别以1%羧甲基纤维素钠、1%微晶纤维素、1%水杨苷、1%木聚糖、50 mg滤纸为底物，测定纤维素内切酶、外切酶、β-糖苷酶、半纤维素酶和总纤维素酶活性[21]。用柠檬酸缓冲液稀释酶液，于50℃下反应30 min（测滤纸酶活反应1 h），加3 mL 3，5-二硝基水杨酸，煮沸5 min，紫外分光光度计540 nm波长下测定吸光值并计算酶活。以每分钟催化水解产生1 μg葡萄糖所需酶量为1个酶活力单位（U）[22]。

The mRNA level of HMGB1 in the myocardium of the baseline group was positively correlated with the expression of TLR-4,RAGE,and NF-κB(r=0.904,P ＜0.000;R=0.952,P＜0.000;r=0.909,P=0.002,respectively,Figure 5).

2 结果与分析

2.1 各处理组pH变化

图1为各处理组在好氧水解阶段pH变化图。好氧水解阶段微生物首先分泌胞外酶，像淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等酶类，将料液中易降解成分，降解成还原糖、可溶性酸、多肽、氨基酸等可被微生物直接利用小分子可溶性物质，例如纤维素被分解成纤维二糖、葡萄糖，蛋白质被水解为短肽与氨基酸，淀粉被淀粉酶分解为麦芽糖和葡萄糖。随好氧水解反应，料液中微生物浓度增高，对料液降解速度增加，这个过程中由于有机酸、还原糖等小分子可溶性物质大量产生，而在好氧过程中因为产甲烷菌是严格厌氧菌，其活性被抑制，对产生有机酸、还原糖等物质无法利用，有机酸和还原糖仅有少量被好氧微生物合成自身细胞结构，导致有机酸积累，pH急剧下降，但该过程一般需要几个小时，造成前8 h pH急剧降低。但前4 h G、H、I三组pH下降较其他组迅速，因其他组均采用额外供气方式，体系中溶氧充足，促进好氧微生物生长繁殖，使好氧微生物在前4 h处于高速繁殖期，消耗料液中部分可溶性物质。8 h后料液pH回升，因此时料液中易降解成分耗尽，同时前期水解酸化产物大量积累，抑制好氧微生物生长繁殖，导致水解酸化速率降低，而为降低酸抑制作用，微生物开启调节模式，产生氨类物质。在此阶段好氧微生物主要对木质素网状结构包裹缠绕难降解纤维素、半纤维素成分开始侵蚀，通过分子氧和胞外酶氧化分解木质素形成网络结构，增加其通透性。20 h后各处理组pH又出现下降趋势，因为随水解反应，木质素所形成屏障逐渐被破坏，通透性增加，纤维素、半纤维素以及其他被包裹大分子物质与胞外酶接触面积增大，降解速率增加。C组即曝气供气木霉和黑曲霉混菌组pH在16 h后显著高于其他组，可能与微生物繁殖速率和活性有关。

2.2 各处理组酶活变化

不同菌种产生各种纤维素酶能力不同，而纤维素酶还是一种诱导酶，不同生长环境会极大影响各种纤维素酶产生和降解纤维素活性，影响纤维素降解率。因此，对好氧水解结束时各处理组五种酶进行活力测定。图2为各处理组五种不同酶活性图，就内切酶和β-糖苷酶来看，C组酶活性最高，而A、E两组酶活性较低，其他各组相差不大。从外切酶活性来看，B组酶活性最高，C组次之，E组最低。作为衡量总纤维素酶活力滤纸酶活，C组活性最高。因此，即采用曝气供气方式纤维素酶活性最高，添加木霉和黑曲霉混菌组。说明曝气供氧方式能够提高木霉和黑曲霉混菌产纤维素酶能力，木霉和黑曲霉在曝气供氧时可以协同生长。这可能与曝气供气供氧较充分有关。C组外切酶活、内切酶活、β-糖苷酶、滤纸酶活分别为37.18、73.33、58.94和45.79 U，由此可见滤纸酶活并非各酶活简单相加，是各种酶协同作用结果。图2中最上部代表半纤维素酶活曲线，酶活性较高，均在140 U以上，其中B组、C组、E组和F组半纤维素酶活性显著高于其他组，可能与黑曲霉添加有关。

2.3 各处理组纤维素含量变化

图3为好氧水解结束后各试验组纤维素和半纤维素含量图，由图可知半纤维素含量均在20%以下，原稻秸半纤维素含量为30%。说明在水解阶段半纤维素降解明显。C组半纤维素含量最低，说明在好氧水解过程C组半纤维素被降解最多。这与图2中C组半纤维酶活性较高相互应。通过图中纤维素含量图柱高度可以看出各处理组经过好氧水解阶段后纤维素含量均在26%以下，其中C组含量最低约21%，而原稻秸纤维素质量分数为35.72%，其含量降低约15%，说明曝气供气混菌组对纤维素降解效果较好。与C组全纤维素酶活性最高相一致。因此采取曝气供气方式以木霉和黑曲霉混合菌进行稻秸好氧水解发酵有利于半纤维素和纤维素降解。

图1 各处理组pH变化Fig.1pH of each treatment group

图2 各处理组五种酶活性Fig.2Five enzyme activity curves of each treatment group

2.4 各处理组日产气量变化

沼气是秸秆厌氧发酵终产物之一，因此日产气量是衡量秸秆厌氧发酵效果重要参数之一。图4为各处理组日产气量图。由图可见各处理组日产气量趋势基本相同，均是在厌氧发酵第三天达到峰值，其中C组和F组达到峰值时日产气量最高。这可能与C组和F组好氧水解阶段半纤维素降解量较高有关。到产气中期时保持平稳，其中C组和F组在产气中期出现产气小高峰时间较其他组滞后，但产气量显著高于其他组，这可能是由于C组和F组纤维素、半纤维素降解量高于其他各组，好氧水解效果较好。因此，木霉和黑曲霉混菌更有利于产甲烷发酵。在产气后期由于产气量较少，选择3 d测一次气体产量，各组又出现新产气小高峰，原因可能是经过好氧阶段木质纤维素结构松散，更易被厌氧菌降解利用。各试验组日产气量比较来，C组日产气量最高，其次是F组，而H组最低，其中C组和F组均是木霉和黑曲霉混合菌组，只是采取供气方式不同，说明木霉和黑曲霉在外界供氧条件下两种菌未产生抑制作用，可以提高日产气量。C组显著高于F组，说明曝气供气方式更有利于木霉和黑曲霉混合菌生长。由图4可知，B组和E组日产气量仅次于C组和F组，即在好氧厌氧发酵工艺中黑曲霉较木霉有利于提高厌氧发酵日产气量。

图3 各处理组纤维素半纤维素含量Fig.3Cellulose and hemicellulose contents of all treatment groups

图4 各处理组日产气量Fig.4Daily biogas production of all pretreatments

2.5各处理组甲烷含量变化

甲烷含量高低决定生物气品味，图5为各处理组甲烷含量图。由图可见在厌氧发酵前4 d甲烷含量迅速升高，是因为在发酵前期体系经过好氧水解过程后，易被产甲烷菌利用小分子物质充足，产甲烷菌活性很强，直到厌氧发酵反应中期，体系中仍保持较高甲烷含量，并保持平稳；到产气发酵后期甲烷含量开始下降，甲烷含量仍保持在50%以上，说明产甲烷微生物活性较高。在各处理组中，C组甲烷含量仍保持在较高水平，甲烷含量最高达到70%以上，说明木霉黑曲霉混菌采用曝气供气水解效果较好，有利于厌氧产甲烷发酵，因曝气供气方式供氧量充足，促进木质纤维素网状结构破坏，降低产甲烷菌对纤维素利用难度，增强产甲烷菌活性。

图5 各处理组甲烷质量分数Fig.5Methane concentrations of all treatments

2.6 各处理组累积产甲烷量

图6为各处理组累积产甲烷量图，累积产甲烷量是产气量和甲烷含量综合结果，是衡量厌氧发酵体系综合指标。由图可见C组和F组累积产甲烷量显著高于其他组，说明C组和F组体系厌氧发酵效果较好。累积产甲烷量最高是C组，即木霉和黑曲霉混菌采用曝气供气方式处理组。出现该结果主要原因是C组在水解阶段木霉和黑曲霉产生协同作用，活性较高，酶活力强，纤维素、半纤维素降解较多，木质素包裹作用减弱，促进厌氧发酵，使气体产量增加，同时，经过好氧水解后，木质纤维素结构松散，易于被产甲烷菌利用，使甲烷含量增加。而F组累积产甲烷量也较高，并且I组累积产甲烷量比G组和H组高，说明在好氧水解阶段添加木霉和黑曲霉混合菌对厌氧发酵产气品质改善效果较单一菌种更好。通过图6还可见在反应前期各处理组累积产甲烷量增速均较快，主要是因为反应前期料液中易降解有机质丰富，产气量高，第7天各处理组累积产甲烷量增长速度减缓，各组间累积产甲烷量出现明显差距，水解阶段微生物作用效果逐渐体现。

图6 各处理组累积产甲烷量Fig.6Cumulative methane production of all treatments

2.7各处理组TS产气量

TS产气量代表单位干物质产沼气量，反映有机物降解利用率，其值越大，有机物降解利用率越高，是综合衡量发酵体系厌氧发酵性能指标。图7为各处理组TS产气量。由图可知TS产气量最高是C组，即木霉和黑曲霉混菌曝气供气方式组最高，达到438.57mL·g-1，与前面纤维素和半纤维素降解量相一致。由图7可知，A、B两组TS产气量相近，D、E两组以及G、H两组TS产气量也均相近，但增均显著低于C组木霉和黑曲霉混菌组，说明木霉和黑曲霉单一菌种对提高纤维素降解率相差不大，混菌较单一菌对提高水稻秸秆降解利用效果更好，可能是因为木霉和黑曲霉混合添加，相互促进生长，产生协同作用。混菌F组即搅拌供气方式混菌组其TS产气量较C组稍低，由于木霉和黑曲霉混菌对氧气需求量较高，搅拌组供氧量较低，好氧水解阶段兼性厌氧菌增加，增加厌氧发酵阶段兼性厌氧菌数量，影响产甲烷菌活性。

图7 各处理组TS产气量Fig.7Biogas yield of TS in each treatments

3 讨论

水稻秸秆作为植物光合作用产物，富含有机质，具备可再生性，是良好生物质资源，但高含量木质素制约其厌氧发酵制沼气工艺发展。水稻秸秆中纤维素、半纤维素和木质素均为可再生有机物，但木质素因结构中含各种生物学稳定复杂键型和不易被水解重复单元[23]，使木质素对厌氧发酵过程中产生酶形成抗性，成为不易降解有机物。微纤维形成过程中，木质素和半纤维素作为填充剂和粘合剂与纤维素相互交织，形成一层物理屏障，导致任何一类成分降解必然受到其他成分制约，主要表现在木质素对纤维素酶和半纤维素酶降解秸秆中碳水化合物空间阻碍作用[24]，水稻秸厌氧发酵过程缓慢，产气率低。木质素对微生物抵抗作用主要包括酚基团氧化性、单体结构单元之间连接次序、细胞壁物化状态以及木质素网络胶状超级结构[25-26]。因此提高水稻秸秆厌氧发酵纤维素利用率关键是降低木质素对微生物抵抗作用。

通过研究发现分子氧能促进木质素最初裂解，因此学者多采用好氧方式促进木质素裂解，降低木质素对微生物抵抗作用。好氧方式提高木质素降解率研究主要集中在干法好氧堆沤方面，湿法好氧发酵处理秸秆领域鲜有研究，并且好氧微生物繁殖速率远大于厌氧微生物，因此本文采用添加好氧微生物湿法好氧处理方式进行水解产酸发酵，采用湿法厌氧发酵方式进行产甲烷发酵。通过分子氧破坏木质素分子结构，减少木质素空间阻碍作用，添加木霉和黑曲霉增加纤维素酶产量，提高纤维素降解率，提升厌氧发酵阶段气体产量和品质。

试验结果表明，湿法好氧水解阶段添加木霉和黑曲霉菌，水解过程中酶活性较高，好氧水解效果较好，其中木霉和黑曲霉混菌未出现微生物间抑制作用，产生协同作用，提高厌氧发酵TS产气率。但是不同供气方式组微生物酶活以及纤维素降解量差别显著，这可能是由于不同供气方式料液里溶氧量不同，木霉和黑曲霉生长繁殖速率及产酶活性不同。因此后续研究中可探讨不同供气方式供氧量、料液溶氧量、微生物生长繁殖情况、产酶种类、酶活性等，寻找供气方式与溶氧量、微生物种类关系，为工业化生产提供基础数据支持。

4 结论

a.通过对水稻秸秆好氧厌氧两相发酵工艺中水解阶段添加木霉和黑曲霉两种好氧菌，发现木霉和黑曲霉混菌各组酶活性较单一菌种活性更高，纤维素、半纤维素降解率高，日产气量显著增加，利于厌氧发酵进行。曝气供气方式供氧更充足，酶活和木质纤维素降解率最高。

b.同一供气方式添加木霉和黑曲霉单一菌种TS产气量较为接近，但均显著低于C组，即采用曝气供气方式木霉和黑曲霉混菌组其TS产气量最高，达438.57 mL·g-1。

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Effect of microbial inoculants on combined aerobic and anaerobic twophase fermentation of rice straw for biogas production

LI Wenzhe,DING Qinghua,LUO Lina,FAN Jinxia,LI Pengfei,WANG Jinqiu

(School of Engineering,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to improve the degradation rate of rice straw in the combined aerobic and anaerobicfermentationprocess,differentmicrobialinoculantswereemployedtoimprovethe degradation rate of cellulose in the aerobic hydrolysis stage.The results showed that the mixed strains could obtain better cellulosic degradation than the applied with single strain in each treatment.The treatment of Aspergillus mixed withTrichodermaby aeration gas supply obtained the best total cellulase activity,degradation rate of cellulose and cumulative biogas yield of 438.57 mL·g-1.Therefore,the degradation rate of rice straw could be improved by adding mixed strains of Aspergillus and Trichodermato the aerobic stage by aeration gas supply.

Trichoderma;Aspergillus;cellulose degradation;enzyme activity;gas production characteristics

S216.4

A

1005-9369（2016）05-0098-08

2016-03-16

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2014BAD02B04）

李文哲（1955-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为农畜废弃物资源化利用。E-mail:liwenzhe9@163.com

时间2016-5-27 16:16:16[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160527.1616.028.html