杜伟斌全仁夫郑宣李强曹国平庄伟邵荣学杨迪生

·论著·

毛囊干细胞体外诱导成血管内皮细胞的实验研究

杜伟斌1全仁夫1郑宣1李强1曹国平1庄伟1邵荣学2杨迪生3

目的 建立简单、可靠的毛囊干细胞体外定向分化为血管内皮细胞的方法。方法 无菌条件下切取1周龄SD大鼠触须部皮肤，Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化，显微镜下分离毛囊隆突部，改良的组织块贴壁法培养rHFSCs，差速贴壁法纯化，流式细胞仪检测及细胞免疫荧光染色联合鉴定。用含10 ng/ml和20 ng/ml VEGF165作为主要诱导因子将细胞分为两种浓度组别，不传代的情况下分别在1、2、3周内观察诱导后细胞形态；通过流式细胞和细胞免疫荧光染色检测分化效率；选取最佳诱导因子浓度和工作时间，对诱导后的细胞进行体外官腔形成实验，并在透射电镜下观察W-P小体。流式细胞术检测分化效率实验数据的比较采用单因素方差分析及独立t检验。结果 分离、培养、纯化的rHFSCs克隆能力好，活力强，生长曲线呈S型。流式细胞及免疫荧光染色联合检测β1（98.9﹪）、α6整合素（97.9﹪），CK15（68.1﹪）、P63（98.5﹪）呈高表达，阴性表达CD31（13.6﹪）、VE-cadherin（17.9﹪）。在诱导液的作用下，两组细胞从1周到3周后，均由扁平铺路石样改变到完全被长梭形样细胞占据。流式细胞及免疫荧光染色检测CD31和VE-cadherin显示，CD31在诱导1周时表达最强，两种诱导因子比较无差异[（65.27±0.57﹪）vs（66.13±0.60）﹪，t = -1.812，P = 0.145]。而VE-cadherin在诱导1周时表达也最强，10 ng/ml要优于20 ng/ml VEGF165的诱导作用[（95.57±0.85）﹪ vs（78.10±1.25）﹪，t = 19.977，P = 0.001]。10 ng/ml VEGF165诱导1周后的细胞体外管腔形成实验阳性，在透射电镜下可以观察到内皮细胞特有结构W-P小体。结论 毛囊干细胞体外在10ng/ml VEGF165的诱导下，1周后可成功得到性能良好的血管内皮细胞。……