王立妍，陈玉芳，王丹，汪涛

（1天津中医药大学护理学院，天津 300193；2天津医科大学总医院中医科，天津 300052；3天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193）

当归补血汤促进异体移植的肌卫星细胞存活

王立妍1，陈玉芳1，王丹2，汪涛3*

（1天津中医药大学护理学院，天津 300193；2天津医科大学总医院中医科，天津 300052；3天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193）

目的 应用原位杂交技术观察当归补血汤对移植肌卫星细胞受体鼠造血功能重建的影响。方法 对4组受体鼠的骨组织石蜡切片进行原位杂交，探究Y染色体的存在及阳性细胞表达率。结果 除空白对照组，其余3组（移植肌卫星细胞＋灌注生理盐水组、移植肌卫星细胞＋灌注等倍当归补血汤组、移植肌卫星细胞＋灌注5倍当归补血汤组）均呈阳性反应，且阳性细胞表达率差异具有统计学意义。结论 原位杂交技术可以证明雌性小鼠骨组织中的Y染色体来自于雄性供体肌卫星细胞，当归补血汤干预有助于受体鼠造血功能重建，为后续研究提供进一步的实验室依据。

原位杂交技术；当归补血汤；肌卫星细胞；Y染色体

随着人们生活方式和环境的改变，人类的疾病谱也发生了相应的变化，血液系统疾病发病率呈现上升趋势。肌卫星细胞（muscle satellite cell，MSC）是一种静止的成体干细胞，位于肌纤维膜与基膜之间，在诱导刺激下会活化成动态MSC，增殖和分化为多种细胞类型［1-2］。有研究者经小鼠尾静脉注射MSC，之后对小鼠骨髓单个核细胞进行化学染色并观察脾结节形态，发现早期会出现相对较多的造血细胞并且脾结节有增多现象，证实MSC具有造血重建的潜能［3］，为血液系统疾病患者临床治疗带来新的希望。

当归补血汤由黄芪和当归两药以5：1配伍组成，多用于气血虚、劳倦内伤及阳浮于外之虚热证。有研究表明，当归补血汤具有改善造血微环境、刺激造血干细胞增殖分化、抑制造血干细胞凋亡和提高机体免疫力等调节和促进造血的作用［4］。

为了探讨当归补血汤是否能促进肌卫星细胞移植的造血功能重建作用，本研究从同种异体雄性小鼠中提取出的肌卫星细胞移植到照射后的雌性受体鼠内，并协同不同剂量的当归补血汤处理受体鼠后，应用原位杂交技术探查雌性小鼠骨髓Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）基因表达，为当归补血汤预处理结合肌卫星细胞移植治疗血液病及其相关疾病提供理论依据。

材料和方法

1 肌卫星细胞的分离培养

无菌条件下取乳鼠后肢骨骼肌，剔除脂肪、筋膜等，剪碎组织块，培养基冲洗后静置，去上层液及飘浮组织。加入0.1%Ⅱ型胶原酶，37℃消化20min，再加入0.125%胰蛋白酶消化5min，后加入少许血清终止消化，1000r／min离心10min，弃去上清液，加入培养液吹打后，400目尼龙网过滤，收集滤液离心，弃去上清液，加入含20%胎牛血清的培养基重悬移入培养瓶中，差速1h后，吸上清液，计数后用于移植或以1×105个／cm2密度接种培养。2d后第一次换液。

2 气血两虚证小鼠模型制作及肌卫星细胞移植

利用射线照射小鼠全身，造成血细胞数量下降和骨髓损伤，制作气血两虚证小鼠模型［5］。将受体小鼠装入有机玻璃鼠盒内，经8Gy137Cs-γ射线全身一次性致死剂量照射15min。照射后4～6h，除对照组之外，其余小鼠经尾静脉输注雄性供体鼠 MSC，移植后小鼠在无菌层流架内饲养，水、饲料、垫料均经高温高压消毒。

3 当归补血汤水煎剂给药

古方中当归补血汤（Chinese angelica blood tonic，CABT）的总剂量为36g／d，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量计算法”计算出小鼠临床等倍用药剂量和5倍用药剂量。将中药复方剂按照黄芪与当归5：1的量浸泡于蒸馏水中，每克中药加水6ml，浸泡30min；武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤后收集煎液，原渣再加水煎煮40min，二煎每克加水4ml，过滤取煎液，两者混合，4℃保存备用。于 MSC移植后对小鼠采取0.2ml药量灌胃，共灌药7次，其中等倍剂量组每毫升药液含中药0.675g，5倍剂量组每毫升药液含中药3.375g。

4 制片

取小鼠双下肢，分离双侧股骨和胫骨，置于10%的甲醛溶液中固定24h，然后置于2%的硝酸溶液中过夜脱钙完全；按常规步骤将标本放于不同浓度乙醇溶液和二甲苯中进行脱水、透明，石蜡包埋、连续切片（3～5μm）；将切片裱于多聚赖氨酸处理的载玻片上后进行原位杂交反应。

5 原位杂交

小鼠SRY DNA生物素标记（POD）原位杂交双染色系统试剂盒由灏洋生物公司提供。根据使用说明进行以下操作。①标本脱蜡：二甲苯2次，100%无水乙醇2次，95%乙醇1次，75%乙醇1次，每次5min。②去除核酸表面蛋白质，增加组织通透性：组织表面滴加3%H2O2去离子水，室温10min（实验室条件为20℃）。③消化酶充分消化：组织表面滴加SRY试剂B（复合消化工作液），放入湿盒，室温孵育10min。④0.1mol／L TBS溶液（pH7.8）冲洗标本5次，每次5min；100℃ 0.1mol／L TBS溶液（pH 8.9）孵育 20min，后迅速以0.1mol／L冷TBS溶液（pH7.8）冲洗3次，每次5min（0℃洗涤）；0.2×SSC溶液冲洗1次，每次5min（0℃洗涤）。⑤杂交：滴加SRY试剂A（杂交工作液）覆盖组织表面，放入湿盒，温箱37℃孵育过夜。⑥杂交后的洗涤：2×SSC溶液37℃冲洗3次，每次孵育5min；0.2×SSC溶液，37℃冲洗3次，每次孵育 5min；0.1 mol／L TBS溶液（pH7.8），37℃冲洗5次，每次孵育2min。⑦封闭液封闭：滴加SRY试剂C（POD转化剂）覆盖组织，放入湿盒，37℃温箱孵育45min。0.01mol／L PBS溶液冲洗 3次，每次洗涤5min。⑧显色：SRY试剂F（DAB）显色，光学显微镜下观察至细胞内胞质阳性颜色与细胞外背景颜色对比度反差明显时，蒸馏水洗终止反应（显色时间约为20min）。细胞核显棕黄色颗粒为阳性反应。⑨苏木复染：标本浸入苏木素10min，复染后流水振洗；置于盐酸酒精中数秒，流水振洗；氨水返兰，流水振洗。⑩标本脱水：75%乙醇1次，95%乙醇 1次，100%无水乙醇 2次，二甲苯2次，每次5min。中性树胶封片保留。

6 统计学分析

应用Image Pro-Plus图像分析软件对杂交反应结果进行定量检测（平均光密度），以SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

对小鼠骨髓进行SRY原位杂交显示，未移植MSC的气血两虚证小鼠（Control组）骨髓SRY杂交反应为阴性（图1A），移植MSC的气血两虚证小鼠（MSC组）骨髓内可见少量SRY杂交反应阳性细胞，阳性细胞核内可见棕黄色阳性反应产物（图1B）。移植MSC＋灌注等倍当归补血汤的气血两虚证小鼠（MSC＋CABT组）骨髓中SRY杂交反应阳性表达率较MSC组明显增加，阳性反应增强（图 1C，表1）。而在MSC移植＋5倍当归补血汤组（MSC＋5× CABT组），SRY杂交反应阳性表达率最高，阳性反应产物平均光密度也最高（图1D，表1）。

图1　当归补血汤对移植肌卫星细胞气血两虚证小鼠骨髓SRY表达影响的原位杂交检测。A，Control组；B，MSC组；C，MSC＋CABT组；D，MSC＋5×CABT组；箭头示原位杂交反应阳性细胞；比例尺，12.5μmFig.1　In situ hybridization detection of the effect of CABT on the expression of SRY in the bone marrow of the MSC-transplanted mice with qi-blood deficiency.A，Control group；B，MSC group；C，MSC＋CABT group；D，MSC＋5×CABT group；arrows indicates in situ hybridization positive cells；scale bar，12.5 μm.

表1　当归补血汤对移植肌卫星细胞气血两虚证小鼠骨髓　SRY表达水平影响的比较Table 1　Comparison of the effects of CABT on the expression level of SRY in the bone marrow of the MSC-transplanted mice with qi-blood deficiency

讨　论

SRY是Y染色体上特有的基因，不仅可以追踪观察移植细胞的存活、转归［6］，而且在细胞分化过程中都不会发生减弱和丢失现象，明显优于其它追踪方法［7］。因此，本实验采用SRY原位杂交方法来追踪雌性受体鼠体内的雄性肌卫星细胞的存活、转归和功能状况，结果发现，在气血两虚雌性小鼠移植MSC后，其骨髓内检测到SRY表达，证实了来源于雄性小鼠的肌卫星细胞能在受体鼠体内存活，并可能参与了雌性受体鼠的造血重建的过程。这表明肌卫星细胞确具有重建造血的能力［8］。肌卫星细胞可能通过改善受体鼠内的微环境，使肌卫星细胞充分转化为造血细胞，以重建小鼠的造血功能。

当归补血汤（CABT）多用于气血虚、劳倦内伤及阳浮于外之虚热证，具有改善造血微环境、刺激造血干细胞增殖分化和提高机体免疫力等调节和促进造血等作用［9-10］。本研究中，在移植MSC的气血两虚雌性小鼠灌注CABT后，其骨髓内SRY阳性表达率增高，表达水平上升，尤以灌注5倍CABT的小鼠更为明显，说明CABT经过补气改善与血虚相伴的机体功能下降，进而达到诱导肌卫星细胞有效分化的目的，从而促进气血两虚中血细胞的恢复［11］，即“气能生血”，由此促进移植的MSC在骨髓内存活、转归及增强造血功能重建的作用。

［1］王静，宋新磊，崔焕先，等.骨骼肌卫星细胞的特性及其增殖与分化的调控.细胞生物学杂志，2007，29（4）：497-502.

[2]Bentzinger CF,Wang YX,Dumont NA,et al.Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.EMBO Rep, 2013,14(12):1062-1072.

［3］汪涛，唐军民，唐岩.骨骼肌卫星细胞造血重建作用的研究.天津医科大学学报，2005，11（2）：178-179，186.

［4］冯璟，于远望.当归补血汤对60Co-γ射线辐照小鼠造血功能损伤的防护作用.中医药导报，2016，22（10）：18-21.

［5］金若敏，宁炼，陈长勋，等.血虚模型动物制备及当归补血汤的作用研究.中成药，2001，23（4）：268-271.

［6］孔佩艳，陈幸华，罗成基，等.Sry监测体外扩增造血细胞植入效果的实验研究.重庆医学，2003，32（10）：1288-1291.

［7］吴凤岚，周晓飞，曹巍，等.Y染色体原位杂交在追踪间充质干细胞上的应用.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（45）：8924-8928.

［8］Brack AS，Rando TA.Tissue-specific stem cells：lessons from the skeletal muscle satellite cell.Cell Stem Cell，2012，10（5）：504-514.

［9］方晓艳，苗明三.当归补血汤粗多糖补气生血作用研究和组方合理性探讨.时珍国医国药，2010，21（1）：93-94.

［10］冯璟，于远望.当归补血汤对辐射损伤小鼠免疫功能的影响.中医药导报，2016，22（13）：17-20.

［11］王晓玲，汪涛，汪雅妮.当归补血汤干预移植肌卫星细胞受体小鼠造血功能重建的研究.中国中西医结合杂志，2011，31（8）：1093-1096.

Chinese angelica blood tonic promotes the survival of allograft muscle satellite cells

Wang Liyan1,Chen Yufang1,Wang Dan2,Wang Tao3*
（1College of Nursing，3College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193；2Department of Traditional Chinese Medicine，General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052）

Objective To study the effect of Chinese angelica blood tonic(CABT)on the hematopoietic reconstruction of muscle satellite cell(MSC)in allograft mouse by in situ hybridization.Methods:Y chromosomes were detected by In situ hybridization in paraffin sections of bone tissue from four groups of receptor female mice.Results:Except for the control group,Y chromosomes were detected in the other three groups(MSC＋normal saline,MSC＋equivalent CABT,MCS＋5 times of CABT),and the difference between control and CABT groups is of statistical significance.Conclusion:The Y chromosomes in the bone tissue of the female mice were identified from the MSCs of male donors by in situ hybridization,which confirmed that CABT facilitated hematopoietic reconstruction in the receptor mice.This provides a basis for further experimental study of CABT function.

In situ hybridization technology；receptor mice；muscle satellite cells；Y chromosome

Q462

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.008

2015-04-06

2016-09-02

国家自然科学基金项目（81273892）（81673732）

王立妍，女（1987年），汉族，助教

（To whom correspondence should be addressed）：wangtao6112＠163.com