董志勇 李建平徐静 王冠梁黄晓刚林伟

肝细胞癌（heptocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌发病率约为25.7/10万，其中HCC占肝癌的80%以上，死亡率仅次于胃癌和肺癌［1，2］。甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）是目前唯一推荐用于HCC监测的血清标志物［3］，但近年有研究发现高尔基蛋白-73（Golgi protein-73，GP73）在 HCC患者血清中显著增高，其诊断HCC的敏感度和特异度均高于 AFP，可能是 HCC 早期诊断的更好标志物［4，5］。本研究采用Western blot法检测HCC患者血清中GP73的表达水平，探讨GP73对HCC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2012年8月至2015年1月于莆田学院附属医院、广西医科大学第一附属医院住院的31例HCC患者为HCC组，其中男性26例，女性5例；年龄50～70 岁，平均年龄（61.35±5.68）岁。所有患者均为符合巴塞罗那临床肝癌分期系统诊断标准的早期HCC［6］，均经术后病理学检查证实，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原均阳性；肝功能正常或Child-Pugh分级为A级；无合并其他肿瘤和严重心肺功能异常等。同时选取同期于莆田学院附属医院体检的31名健康志愿者为健康对照组，其中男性18名，女性 13名；年龄 50～70岁，平均年龄（58.35±6.40）岁，HBV表面抗原均阴性，肝功能生化指标检测正常，无其他系统疾病。两组入组前均签署知情同意书，且两组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 标本采集

抽取待检者清晨空腹静脉血2 mL置于加抗凝剂试管中，室温静置1 h，5 000 r/min离心5 min，分离血清后置-20℃冰箱保存，备用。

1.3 检测方法

1.3.1 主要设备及试剂 GP73蛋白检测试剂盒（热景生物技术有限公司），Western blot装置（Bio-Rad公司），PVDF膜（博光科技公司），5415D低温离心机（Heraus公司），小型电泳仪PAC-300（Bio-Rad公司），Multi-analytist成像系统（G：BOX），TS-I型脱色摇床（林贝尔仪器制造有限公司），垂直电泳槽（Bio-Rad公司）；Anti-GP73鼠单抗、Anti-鼠二抗（BD公司）。MOPs电泳缓冲液、TBST缓冲液、PBS、红细胞裂解液、DMEM培养基等。

1.3.2 Western blot法检测GP73蛋白的表达 取待测血清 4 μL加入 1×上样缓冲液 76 μL，100℃灭活 5 min。4%～12%丙烯酰胺梯度预制胶和MOPs电泳缓冲液进行电泳，上样量为每孔10 μL，含0.5 μL血清。电泳结束后转膜：4%牛奶室温封闭1 h后置于杂交膜内，加GP73 鼠单抗（1∶2 000）或 GP73 多抗（1∶1 000），4℃摇床孵育12 h。TBST洗脱3次，每次10 min；加Anti-鼠二抗（1∶10 000）室温孵育 1 h，TBST 洗脱 3 次，每次10 min，ECL暗室曝光。取最好的3次结果使用Image quant 5.2软件分析各条带的灰度值。以待测样品灰度值与标准正常血清灰度值的比值设为GP73的相对单位，采用GP73蛋白检测ROC曲线某一较佳截断值对应的灰度值来计算阳性率和阴性率。

1.4 统计学分析

采用SPSS l3.0软件进行统计学分析。因数据呈偏态分布，用中位数（四分位数间距）表示，两组比较采用Mann Whitney检验。阳性率比较采用χ2检验。制作受试者工作特征曲线（ROC），同时报告曲线下面积及95%可信区间，计算GP73诊断HCC的敏感度、特异度和ROC曲线下面积。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清GP73检出率的比较

HCC组和健康对照组GP73蛋白阳性表达率分别为 74.19%（23/31）和 9.68%（3/31），两组比较差异有统计学意义（χ2=26.50，P＜0.001）。HCC 组与健康对照组GP73蛋白检测值分别为5.2（2.1～6.9）RU和1.1（1.0～1.6）RU，HCC组约为健康组的 4.7 倍，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 血清GP73诊断HCC的效能

在ROC曲线中，尽量取靠近左上角的截断值作为诊断标准，此时的敏感度和特异度较好。在GP73 ROC曲线上取2.3 RU（GP73浓度为82.2 ng/mL）为截断值时，ROC曲线下面积为0.823（95%CI：0.71～0.93），GP73检测HCC的敏感度和特异度达到最佳，分别为90%和78%。见图1。

图1 血清GP73诊断HCC的ROC曲线

3 讨论

目前认为AFP是诊断HCC的重要标志物，已广泛应用于临床，但仍有部分患者AFP检测结果呈阴性。因此，临床检测中引入新的标志物，对HCC的诊断具有重要意义。Marrero等［7］一项回顾性分析发现，AFP作为早期HCC诊断标志物的阳性预测值为9%～32%，敏感度为39%～64%，特异度为76%～91%。GP73是2000年由Kladney等［8］研究成人巨细胞性肝炎病原学时首次发现的在高尔基体里存在的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73主要由胆管上皮细胞表达，正常肝细胞表达很少甚至不表达，但在肝脏急性炎症或较严重的肝纤维化时，GP73表达明显上调，肝硬化时表达进一步升高，肝癌时达到高峰［9，10］。因此有学者推测GP73可能是诊断HCC更理想的标志物［11］。进一步研究［12～14］证实血清GP73在诊断HCC中较AFP具有更好的敏感度和特异度，可作为诊断HCC的一个可靠标志物。本研究采用Western blot法检测血清中GP73的表达情况，结果HCC组患者阳性表达率及其表达量均显著高于健康对照组，与国内外研究［15，16］报道结果一致。这种机制可能是GP73被前蛋白水解酶弗林水解酶裂解其远端第55个氨基位点，形成分泌型GP73，运输至细胞外，进入血清中，从而致使HCC患者血清中GP73表达水平上调。本研究结果还发现，当设定血清GP73浓度82.2 ng/mL为诊断临界值时，ROC曲线下面积为0.823，其检测HCC的敏感度和特异度均达到最优，分别为90%和78%，与国内外报道［14，17］结果一致，亦优于上述研究报道的AFP检测的敏感度与特异度，提示GP73在HCC诊断中具有较高的临床应用价值。

综上所述，本研究发现GP73在HCC中表达升高，在诊断HCC中具有较高的敏感度和特异度，有望成为HCC的诊断标志物。但由于本研究病例数较少，且未纳入肝硬化、乙型和丙型病毒性肝炎患者进行分析，可能存在一定选择性偏倚；未检测AFP及其与GP73联合检测的效能，无法确定联合检测是否更优；未与ELISA、RT-PCR等检测技术进行比较，无法确定检测技术是否存在差异。因此，本研究结论有待进一步研究证实。

［1］GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators.Global，re-gional，and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death，1990-2013：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013［J］.Lancet，2015，385（9963）：117-171.

［2］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

［3］Howe HL，Wingo PA，Thun MJ，et al.Annual report to the nation on the status of cancer（1973 through 1998），featuring cancers with recent increasing trends［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93（11）：824-842.

［4］Xu JY，Lin D，Li WD，et al.A systematic review of the accuracy of diagnostic test of AFP for Chines primary liver cancer［J］.Chin J Evidbased Med，2009，9（5）：525-530.

［5］Bruix J，Sherman M，American Association for the Study of Liver Diseases.Management of hepatocelluar carcinoma：an update［J］.Hepatology，2011，53（3）：1020-1022.

［6］Llovet JM，Bru C，Bruix J.Prognosis of hepatocellular carcinoma：the BCLC stagingclassification［J］.Semin Liver Dis，1999，19（3）：329-338.

［7］Marrero JA，Romano PR，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2005，43（6）：1007-1012.

［8］Kladney RD，Bulla GA，Guo L，et al.GP73，a novel Golgi-localized protein upregulatedbyviral infection［J］.Gene，2000，249（1-2）：53-65.

［9］何婷婷，易永芬，李艳青，等.胃癌细胞高尔基体蛋白组学技术平台的建议［J］.中国生物工程杂志，2010，30（2）：27-31.

［10］Zhang F，Gu Y，Li X，et al.Up-regulated Golgi phosphoprotein 2（GOLPH 2）expression in lung adenocarcinoma tissue［J］.Clin Biochem，2010，43（12）：983-991.

［11］毛一雷，杨华瑜，徐海峰，等.新的肝癌血清标记物GP73在肝癌诊断中的初步研究［J］.中华医学杂志，2008；88（14）：948-951.

［12］Yang J，Li J，Dai W，et al.Golgi protein 73 as a biomarker for hepatocellular carcinoma：A diagnostic meta-analysis［J］.Exp Ther Med，2015，9（4）：1413-1420.

［13］Mao Y，Yang H，Xu H，et al.Golgi protein 73 （GOLPH2）is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.Gut，2010，59（12）：1687-1693.

［14］陈旺，杨华瑜,毛一雷，等.高尔基蛋白73单克隆抗体在肝细胞肝癌诊断中的价值［J］.中国医学科学院学报，2011，33（1）：39-44.

［15］王秀娟，匡志鹏，吴继宁.WFDC-1基因在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义［J］，中国癌症防治杂，2011，3（1）：35-38.

［16］Bossuyt PM，Reitsma JB，Bruns DE，et al.The STARD statement for reportingstudiesof diagnosticaccuracy：explanationandelaboration［J］.Clin Chem，2003，49（1）：7-18.

［17］Hu JS，Wu DW，Liang S，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B-endemic Asian population［J］.Med Oncol，2010，27（2）：339-345.