安彩霞，王红娟，刘文先，胡　雯，赵亚楠，普雄明

体外培养自体黑素细胞移植治疗白癜风78例疗效观察

安彩霞，王红娟，刘文先，胡雯，赵亚楠，普雄明

安彩霞

目的评价自体黑素细胞培养移植治疗白癜风的疗效和影响因素。方法临床选择稳定期白癜风患者78例，采用自体黑素细胞培养与移植治疗方法，记录疗效和并发症，分析可能影响因素。结果78例患者总计189处皮损，98处皮损（51.85%）获得了90%以上的复色，53处皮损（28.04%）获得了50%～90%以上的复色，总有效率达到79.89%；节段型白癜风患者有效率为86.04%，优于局限型白癜风患者（83.54%）和泛发型白癜风患者（71.64%）的治疗效果；面颈部位的皮损治疗效果最佳（有效率87.80%），要优于躯干部（83.67%）和四肢部位（80.39%），手足部位治疗效果最差（有效率68.75%），黑素细胞分裂时间≤3.5 d的移植有效率明显高于＞3.5 d者（P＜0.05）。结论自体培养黑素细胞移植是治疗稳定期白癜风的一种有效方法，其疗效与白癜风的分型、皮损的部位和黑素细胞的生物活性有关。

白癜风；黑素细胞；移植

白癜风是皮肤科常见的色素减退性疾病，发病机制不明，治疗困难[1,2]。针对白癜风不同的分型分期，需要采用不同的治疗手段。对于稳定期白癜风，在药物和紫外线治疗效果欠佳的情况下，手术治疗是个不错的选择。既往笔者多采用自体表皮移植治疗，但皮源有限，对于大面积及特殊部位白癜风效果欠佳[3]。而自体培养黑素细胞移植治疗，取小面积的表皮即可培养出大量的黑素细胞，从而治疗面积较大的白癜风皮损，是目前治疗大面积稳定期白癜风效果较佳的办法，但仍有一些临床应用问题尚需解决[4]。笔者所在科室2012—2015年使用自体培养黑素细胞移植治疗95例稳定期白癜风患者，17例失访，随访并观察了其中78例患者，现将治疗结果报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料

本研究共纳入患者78例，其中 男37例（47.44%），女41例（52.56%）；平均年龄（35.62±3.24）岁（7～67岁）；汉族45例，维族23例，回族6例，蒙古族2例，哈萨克族2例；18例节段型患者共有皮损43块，35例局限型患者共有皮损79块，25例泛发型患者共有皮损67块。手术部位位于面部者18例，皮损共41块，躯干部29例，皮损49块，四肢及手足部位31例，皮损99块；患者均为稳定期白癜风，病情稳定≥6个月，无其他系统性疾病，如血液病、自身免疫病（如甲状腺疾病、糖尿病）等，非瘢痕体质等。经本院伦理委员会审核同意，所有患者均签署知情同意书和临床资料调查表。

1.2试剂

M2黑素细胞生长培养基（Gibco公司），0.25%胰酶，胎牛血清（Gibco公司）。左旋多巴(L-Dopa，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1黑素细胞的培养使用负压真空吸疱仪在白癜风患者腹部正常皮肤处吸疱6～12个（根据皮损面积决定，负压50 kPa，时间60～90 min，每个疱直径0.8 cm），吸疱完成后，用无菌注射器将疱液吸出，滤器过滤，-20 ℃保存备用。沿疱壁基底部完整剪下疱壁，加入含双抗（青霉素和链霉素）100 U/ml的磷酸盐缓冲液（PBS），室温放置10 min。加入PBS彻底清洗，组织剪碎，加入0.25%胰酶放入4 ℃冰箱消化12～16 h。胎牛血清终止消化，吹打使细胞分散，试管内液体混浊后1 500 r/min离心3 min弃上清，缓冲液冲洗后再次离心和弃上清。加入M2黑素细胞选择性培养基中，置37 ℃，5%CO2培养箱内培养。每3天更换培养液1次，在倒置显微镜下观察黑素细胞形态，观察其生长和增生情况，当黑素细胞融合后，进行传代。培养过程中利用成纤维细胞和角质形成细胞生长速度快的特点，用差速贴壁法及胰酶差速消化法去除角质形成细胞和成纤维细胞污染,同时利用M2黑素细胞选择性培养基培养，以获得高纯度活化可供移植的黑素细胞。

1.3.2黑素细胞的鉴定和计数首先采用抗成纤维细胞和角质形成细胞特异抗原染色，不显色时证明没有这两种细胞的污染，再进行黑素细胞功能的鉴定。

1.3.2.1L-DOPA 染色调整黑素细胞浓度为4×105个/ml，接种于放有盖玻片的6孔板中，待细胞爬满盖玻片80%时，取出盖玻片，用冰PBS洗两次，5%的甲醛固定30 min，再用冰PBS洗两次，加入0.1%左旋多巴磷酸盐缓冲液（pH7.4），放人37 ℃温箱中温浴4 h，弃去多巴液，观察细胞显色程度，L-DOPA阳性反应细胞胞质呈灰色至黑色，证明黑素细胞具有合成黑素的功能。

1.3.2.2黑素细胞的计数倒置显微镜观察细胞形态，并以白细胞计数方法计数，当细胞经3～5次传代，黑素细胞培养数量达到手术要求时[根据实际白斑面积定，（8～14）×104个/ cm2]，进行移植手术。

1.3.2.3黑素细胞分裂时间(DOT)计算[5]每次接种和传代时均计算黑素细胞数量，根据细胞生长倍数(D)和生长时间(T)，按照公式计算DOT（DOT=0.3 T/logD）。

1.3.3黑素细胞的移植培养的黑素细胞用胰酶消化，离心收集，PBS洗3次后，用患者疱液混悬黑素细胞（8 μl/cm2）。患者白斑术区常规消毒，局部麻醉后以磨削机磨削去表皮，深度以可见点状毛细血管出血为度。将混悬的黑素细胞种植于移植区创面，油纱布覆盖创面，外敷含有患者血清液的无菌纱布，待患者平卧休息1 h后用无菌敷料包扎，7～10 d后去除纱布。

1.4临床疗效判定标准

根据白癜风临床分型及疗效标准《草案》[6]。由2位非手术工作人员根据手术前后复色面积判定疗效。痊愈：色素恢复＞90%；显效：白斑部分消失或缩小，恢复正常肤色面积占皮损面积50%～90%；有效：白斑部分减退或缩小，恢复正常肤色面积占皮损面积10%～49%；无效：白斑无变化或缩小，恢复正常肤色面积占皮损面积＜10%。有效率=（痊愈+显效）例数/总例数×100%。

1.4统计学方法

应用SPSS 13.0 统计软件处理数据，各组比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1黑素细胞的培养及鉴定

黑素细胞培养初期，细胞形态呈黑色圆点状，培养1周左右，一部分细胞逐渐由圆形变成梭形，并有2～3个树突。约2周后，黑素细胞数量明显增多，连接成网状，细胞内充满黑素颗粒，细胞呈梭形。原代细胞呈多极性、有折光性的纤维样细胞，传代细胞多为双极性、细长、平行排列。L-DOPA染色：细胞胞质及树突呈黑色或棕褐色，呈阳性反应，可正常合成黑素（图1）。

2.2白癜风患者疗效观察

78例患者均在术后1、3、6个月采集照片，记录疗效。随访时间最长16个月，平均随访时间8个 月。78例患者总计189处皮损，98处（51.85%）皮损获得了90%以上的复色，53处（28.04%）皮损获得了50%～90%以上的复色，总有效率为79.89%。

2.3白癜风患者移植疗效影响因素

表1可见，节段型白癜风患者（有效率86.04%）治疗效果优于局限型白癜风患者（83.54%）和泛发型白癜风患者（71.64%），结果比较差异有统计学意义（χ2分别为14.301，26.043，P均＜0.05）；面颈部的皮损治疗效果最佳（有效率为87.80%），优于躯干部（83.67%）和四肢（80.39%），手足部位治疗效果最差（有效率为68.75%），结果比较差异有统计学意义（χ2分别为12.271，25.056，35.367，P均＜0.05）；DOT≤3.5 d的有效率明显高于DOT＞3.5 d的患者皮损，结果比较差异有统计学意义（χ2=8.30，P＜0.05），而在不同性别、族别和年龄分组间的有效率差异均无统计学意义（P＜0.05）。

图1　倒置显微镜下黑素细胞培养

图2　白癜风患者面颈部皮损移植前后临床变化

图3　白癜风患者腰部皮损移植前后临床表现

表1　白癜风患者皮损移植的疗效评估　（例）

2.4不良反应

供皮区及移植区均未发生同形反应及瘢痕增生，移植部位10～15 d后皮肤创面愈合，移植部位轻微发红，移植区边缘与正常皮肤交界处有浅白色分界线。移植后5～8个月色素恢复稳定，且颜色与邻近正常皮肤接近（图2，3），也有移植后1个月色素即恢复到接近正常肤色的患者。34例患者移植后出现色素沉着，随着时间的推移色素沉着斑逐渐变淡；有2例患者色素恢复后又再次复发，1例于移植区新生色素消退后再次出现白斑，1例为白癜风面积扩大，移植区新生色素消退。有4例患者行2次手术治疗，未见明显不良反应及并发症。

3　讨论

白癜风是由于皮肤黑素细胞的缺失导致的常见色素异常性皮肤病，至今病因不清。皮损通常出现在暴露部位，可造成患者严重的精神和心理压力，并引起社交障碍、抑郁症等疾病，导致生活质量下降[7]。白癜风的治疗方法虽然较多，但疗效并不令人满意，特别当白癜风处于稳定期，外科治疗将是患者和医生不错的选择。随着体外细胞培养技术的发展，使得黑素细胞移植治疗白癜风成为可能[8]，这种方法可以从小面积的供区表皮就可以获得大量的黑素细胞，为一次性治疗大面积的皮损提供了可能。然而，因黑素细胞培养所需技术条件较高，是目前国内外白癜风较前沿的治疗方法，国内外均进行了此方面的临床应用研究。上世纪80年代，Lontz等[9]采用此方法治疗27例白癜风，结果产生不同程度的色素恢复，并且发现色素恢复的程度主要取决于白癜风皮损的部位（面部、躯干与手背疗效最佳），而与疾病活动性无关。我国学者自上世纪90年代开始了黑素细胞培养移植方面的研究和临床应用。Chen等[10]采用 Hu16 培养基，获得自体纯黑素细胞悬液，移植治疗了120 例白癜风患者，84%的局限型稳定期和54%的泛发型稳定期患者完全复色，并成功应用液氮储存黑素细胞移植治疗，患者治疗后复色效果良好。但是，由于此项技术的复杂和白癜风疾病本身的特点，仍有许多临床应用方面的问题需要我们去探索和研究。本研究选择临床属于稳定期的白癜风患者做为受试对象，以保证获得最好的临床效果，避免同形反应等不良反应的发生。本研究结果显示自体黑素细胞移植治疗的总有效率达到79.89%，痊愈率达到51.85%，其疗效是肯定的，但仍有一部分患者未获得良好的治疗效果。我们发现，白癜风临床分型、皮损的部位和黑素细胞的生物学活性均可影响自体黑素细胞移植的疗效，而患者的性别、族别及年龄对于疗效无明显影响。节段型白癜风治疗效果最好，有效率达到86.04%，明显好于泛发型（71.64%），这也与之前的研究结果报告类似[11,12]，分析其原因或与白癜风的发病机制复杂有关。而对于不同部位的治疗效果观察发现，面颈部治疗效果最好，其次为躯干和四肢，最差的是四肢末端，这与移植皮片成活的结果类似，或与手术局部的血供和营养有关[13]；DOT是代表细胞生物活性的重要指标之一[14]，黑素细胞DOT小，表明黑素细胞的分裂和增生能力强，细胞的生物学活性好。本文研究得出DOT≤3.5 d的黑素细胞移植后疗效较好。

总之，自体纯培养黑素细胞移植是治疗稳定期白癜风的有效治疗手段之一，未见严重并发症。其移植疗效受多种因素影响，白癜风类型、皮损部位及个体的黑素细胞培养状态均是重要的影响因素，而且可能存在其他的因素影响治疗效果，尚需我们不断的研究和观察。

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（本文编辑耿建丽）

The clinical observation of cultured autologous melanocytes transplantation in the treatment of vitiligo

AN Cai-xia，WANG Hong-juan，LIU Wen-xian，et al
Department of Dermatology, Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital, Urumqi 830001, China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect and influence factors of cultured autologous melanocytes to transplantation in the treatment of vitiligo. MethodsTo observe the therapeutic effect and influence factors of cultured autologous melanocytes transplantation in the treatment of vitiligo. MethodsSeventy-eight patients with stable vitiligo were enrolled in the study, and the autologous melanocytes cultured in vitro were transplanted onto the depigmented areas of the vitiligo patients. The therapeutic effect and complications were observed, and the influence factors were analyzed. ResultsThe patients had total 189 depigmented lesions. The repigmentation up to 90% or more was seen in 51.85% of the lesions, and the repigmentation over 50% was seen in 79.89% of the lesions. The effective rate of the segmental group was 86.04%, which is better than localized group and generalized group, respectively. A higher cure rate was also seen in patients with facial lesions. The effective rate in patients of DOT≤3.5 d was significantly higher than the patients of DOT＞3.5 d (P＜0.05). ConclusionTransplantation of autologous cultured melanocytes is effective in the treatment of stable vitiligo. The therapeutic efficacy is related to types of vitiligo, locations of lesions and melanocytes biologic activity.

Vitiligo；Melanocytes；Transplantation[J Pract Dermatol, 2016, 9(1):30-33]

R758.41

A

1674-1293(2016)01-0030-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160110

830001 乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院（安彩霞，王红娟，刘文先，胡雯，赵亚楠，普雄明）

安彩霞，副主任医师，研究方向：皮肤外科和色素性皮肤病，E-mail: angelfish_2004@163.com

（2015-09-06

2015-10-29）