张文领, 牟希东, 韦 慧, 杨叶欣, 徐 猛, 罗 渡, 胡隐昌*

(1. 农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州 510380; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306)



四聚乙醛亚致死剂量对福寿螺AchE、GSTs和MFO活性的影响

张文领1,2, 牟希东1, 韦 慧1, 杨叶欣1, 徐 猛1, 罗 渡1, 胡隐昌1*

(1. 农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州 510380; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306)

为了解亚致死剂量四聚乙醛对福寿螺的主要靶标酶和解毒酶活性的影响,研究了0.50 mg/L的四聚乙醛处理不同时间后福寿螺不同组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)的活力变化。结果显示,四聚乙醛对福寿螺具有良好的杀灭效果, 96 h LC50为3.856 mg/L,安全浓度为0.039 mg/L;在用0.50 mg/L的四聚乙醛处理的24 h内,福寿螺鳃和腹足内AchE酶活力分别升高到未处理时的1.565和1.481倍而后下降,肝和肠组织内AchE酶活力分别下降为未处理时的0.132、0.282倍而后升高;不同组织中GSTs酶活力均呈现为“降低—升高—降低”的趋势;不同组织内MFO酶活力均为先下降后上升的趋势。研究表明0.50 mg/L的四聚乙醛能诱导AchE、MFO和GST活性不同程度的增加,解毒酶MFO和GSTs可能在四聚乙醛的代谢中起着一定作用。

四聚乙醛; 福寿螺; 亚致死效应; 解毒酶系

福寿螺[Pomaceacanaliculata(Lamarck)]是世界百种恶性外来入侵物种之一[1],适应性强,繁殖能力高,是危害水稻及各类水生作物的恶性水生动物[2],也是广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)的中间宿主[3]。目前,对福寿螺的防治主要使用杀螺剂。四聚乙醛(metaldehyde)作为中等毒性的杀螺剂,具有在螺体接触或取食后短时间内致死的效果[4]。但由于施于田间后,其在环境中的毒力随着时间延续会逐渐递减到亚致死剂量[5],且连续施用已经导致福寿螺对四聚乙醛产生了抗药性[6]。研究认为杀虫剂的亚致死浓度会诱导机体解毒酶系的变化,害虫在亚致死浓度的选择压力下有利于抗药性的积累和发展[7]。因此在使用杀虫剂时,不仅要关注其防治效果,还应该对其可能的亚致死效应及害虫抗药性风险进行系统研究。目前对杀虫剂亚致死效应的研究主要体现在两个方面,一是对害虫行为、生殖和生长发育的影响[5,8-9];二是对害虫解毒酶系影响的剂量、时序效应及其与代谢抗性相关性的研究[7,10]。

研究认为多功能氧化酶(mixed-functional oxidase, MFO)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases, GSTs)、羧酸酯酶等是动物体内的重要解毒酶系[11]。在杀虫剂等异源物质的解毒代谢中,MFO的重要组分CYP450酶系[12]主要参与生物降解的第一阶段,将化合物在单加氧酶作用下还原为次级代谢产物,然后在GSTs、羧酸酯酶等和抗氧化机制的作用下进一步代谢转化[13]。它们的表达具有组织特异性和可诱导性,在受到药剂等异源物质胁迫时,会在特定的组织中活性增强[14]。目前,关于农药对解毒酶系亚致死效应的研究主要集中于杀虫剂、除草剂残留对昆虫的毒性[15]及水体污染物对海洋鱼、贝类代谢的诱导[16-17]。虽然已有研究报道了杀螺胺乙醇胺盐、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和茶皂素对福寿螺的亚致死效应,包括影响其乙酰胆碱酯酶(AchE)、GSTs和纤维素酶的活性等[18],但作为重要杀螺剂，四聚乙醛对福寿螺的亚致死效应未见报道,本研究从四聚乙醛对福寿螺的急性毒性入手,研究四聚乙醛处理不同时间后福寿螺不同组织内MFO、AchE和GSTs的活性变化,以了解四聚乙醛对福寿螺解毒酶系的诱导作用,指导四聚乙醛的合理使用,为了解解毒酶系活性变化与福寿螺耐药性形成的关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试螺体

试验所用福寿螺均于2015年4月采集于中国水产科学研究院珠江水产研究所外来水生生物入侵风险评估中心(113°13′375′′E,23°03′375′′N),水体未施加任何农药,所用螺体质量为9.32～15.28 g,壳高3.5～4.5 cm。试验时间段内水温为24～38℃,自然光照条件,暂养于去氯充氧的淡水培养箱(150 cm×150 cm×70 cm)中,备用。

1.2 药品及试剂

四聚乙醛(metaldehyde),MYM USA Corp;二硫苏糖醇(DTT)、丙基硫脲嘧啶(PTU)、苯甲基磺酰氟(PMSF),美国SIGMA公司;牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝G-250试剂、NADPH、80%H3PO4,广州威佳;对硝基苯甲醚,麦克林(上海);Tris,MBCHEM;EDTA、KH2PO4、Na2HPO4、NaOH、KCl、NaCl、乙醇、蔗糖、甘油,广州化学试剂厂,均为分析纯。

乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒(货号:A024)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)测定试剂盒(货号:A004)购于南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器

Mettler Toledo AL204电子天平;Neofuge 15R高速冷冻离心机;Eppendorf 5415R离心机;Thermo Multiskan FC酶标仪;METASH UV8000S型紫外可见分光光度计;上海精宏DK-8D型电热恒温水槽;河南天驰YDS-30L液氮罐;上海SX-611酸度计。

1.4 急性毒性测定

每组取2只健康福寿螺置于体积为8 L的塑料盆中,加脱氯自来水4 L,设置8重复,以孔径约0.2 cm×0.2 cm网罩住,防止逃逸。在预试验的基础上,分别设置四聚乙醛浓度为0、1.5、3、4.5、6、8、10、12、16 mg/L。试验期间充氧,不喂食和换水。定期查看,每12 h统计各浓度下的福寿螺死亡率,及时将死亡螺移出水体,试验进行96 h。参考谭晓珍等[19]的研究方法,预测福寿螺的安全浓度。

参考韩文素等[20]取XLC50值作为亚致死浓度,X的取值应考虑实际试验条件及实验动物的种类；应用鱼粉混药饲喂法处理试验福寿螺,在0、2、6、12和24 h 时分别取样;每次取3个福寿螺冰上解剖,每只取少量肝、鳃、肠及腹足组织,相同组织合并,用生理盐水洗去血污,吸水纸吸去水分,置于液氮罐备用;每次取样设置3重复。

1.5 解毒酶活性测定

MFO测定参照王燕红[21]的方法并稍作改进;AchE、GSTs的活性均采用南京建成生物工程研究所的相应试剂盒测定。

1.5.1 MFO酶活性测定[21]

酶液制备:分别从液氮罐中取肝脏、鳃、中肠和腹足组织,剪碎混匀后,精确称量0.05 g,加入1 mL 0.1 mol/L pH 7.8 缓冲液(含 l mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、l mmol/L PTU、l mmol/L PMSF 和 20%甘油),匀浆, 3～6℃,12 000 g 离心 20 min,取上清液用于酶活测定。

MFOO-脱甲基活性测定:配制20 mmol/L对硝基苯甲醚的乙醇溶液,再用预热的 0.1 mol/L pH 7.8 的磷酸缓冲液稀释到2 mmol/L。分别于96孔酶标板中依次加入 100 μL 2 mmol/L 对硝基苯甲醚和90 μL 酶制备液,30℃温育 3 min,加入 10 μL 9.6 mmol/L 的 NADPH(现配现用)开始,反应在30℃下进行。多功能酶标仪在 405 nm 下记录光密度值,每3 min记录1次,共记录15 min。MFO的活力以每分钟每毫克蛋白催化产生的对硝基苯酚的量(nmol)表示(nmol p-nitrophenol/min/mg protein)。

1.5.2 AchE和GST酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所AchE和GSTs测定试剂盒进行测定。按试剂盒说明书制备组织酶液,预留部分酶液进行蛋白含量的测定。AchE活性单位定义为:每毫克组织蛋白在37℃保温6 min,水解反应体系中1 μmol的基质为1个活力单位(U);GSTs活性单位定义为:每毫克组织蛋白,在37℃反应1 min扣除非酶促反应,使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个活力单位。

1.6 蛋白质含量测定

参考Bradford[22]的方法以牛血清蛋白为标准品测定组织酶源蛋白的含量。

1.7 数据统计分析

应用SPSS 19.0的几率值(probit)分析法对急性攻毒试验数据分析,获得24、48、96 h半致死浓度LC50,及毒力回归方程。

荧光定量数据分析采用SPSS软件统计,采用成对数值的t检验(双尾)和单因素方差分析(ANOVA)检验不同组织,不同时间酶活性的差异。并于Excel软件中作图表。

2 结果与分析

2.1 四聚乙醛对福寿螺的急性毒性

试验发现,在用药初期福寿螺分泌少量黏液,活动能力有所下降;处理6 h时,福寿螺继续分泌黏液,腹足部分外露,浮于水面,随后相继关闭厣甲沉于水底,12 h后几乎无活动。说明四聚乙醛具有显著促进福寿螺黏液分泌、抑制其活动的作用。四聚乙醛对福寿螺24、48、96 h的LC50及毒力回归方程见表1。四聚乙醛对福寿螺的安全浓度为96 h LC50值的1%,0.039 mg/L;综合预试验中24 h内福寿螺死亡及耐受能力的实际情况，本试验亚致死浓度XLC50的X值取3%，即以0.5 mg/L作为亚致死浓度进行后续试验[20]。

表1 四聚乙醛对福寿螺的毒力测定结果

2.2 亚致死浓度四聚乙醛对福寿螺不同组织3种酶活性的影响

采用0.5 mg/L的四聚乙醛分别处理福寿螺0、2、6、12及24 h后,福寿螺肝脏、鳃、肠和腹足组织中的AchE、GSTs及MFO酶活性随处理时间延长而变化。

未施药时福寿螺各组织内AchE活力有显著差异(P<0.05),大小关系为:肠>鳃>腹足>肝。肠AchE活力在用药之后24 h内无显著变化(图1)。肝脏中AchE在用药6 h后迅速下降为正常酶活力的13.2%,然后缓慢上升至正常酶活力的28.2%,并在用药12～24 h内维持此酶活状态(图1)。鳃和腹足AchE活力在药剂处理24 h内均先升高后降低。处理后12 h时,鳃组织内AchE活力上升到最大值,为正常酶活力的156.5%,随后急剧下降; 而腹足内AchE活力在处理后6 h时上升至最高,为正常酶活力的148.1%,然后缓慢下降(图1)。

图1 0.5 mg/L四聚乙醛处理后福寿螺不同组织乙酰胆碱酯酶活性变化Fig.1 Dynamics of AchE specific activity in different tissues of Pomacea canaliculata treated with 0.5 mg/L metaldehyde

药剂处理前福寿螺不同组织中GSTs的活性具有显著差异(P<0.05),酶活力大小依次为肝>鳃>肠>腹足(图2)。用0.5 mg/L四聚乙醛处理后,肝组织内GSTs活力在2 h内急剧下降到正常酶活力的64.7%,维持到6 h后继续下降至未处理时的49.6%;鳃组织内GSTs活力整体呈下降趋势;肠组织GSTs活力在6 h内未呈现剧烈变化,到12 h时急剧下降,24 h时仅为正常酶活的64%;腹足中GSTs活性在6 h内缓慢上升至原来的1.222倍,而后急剧下降为处理前的65.8%(图2)。

图2 亚致死浓度四聚乙醛下福寿螺谷胱甘肽-S转移酶活性变化Fig.2 Dynamics of GST specific activity in Pomacea canaliculata treated with metaldehyde at sublethal concentration

药剂处理前MFO酶活性在福寿螺不同组织中同样存在显著差异(P<0.05),从高到低依次为:肠>肝>腹足>鳃(图3)。用0.5 mg/L的四聚乙醛处理后,肠和肝中MFO活力均呈现缓慢下降趋势,在24 h时活力分别下降到正常活力的49.7%、46.2%;腹足内MFO 活力先下降,到6 h和12 h时恢复到处理前水平,到24 h下降至最低,为正常值的36.3%;鳃MFO活力在处理的24 h内均显著低于正常酶活力,变化趋势为先升高后降低(图3)。

图3 亚致死浓度四聚乙醛下福寿螺多功能氧化酶活性变化Fig.3 Dynamics of MFO specific activity in Pomacea canaliculata treated with metaldehyde at sublethal concentration

3 讨论

本研究通过急性毒性试验获得了处理不同时间后四聚乙醛对福寿螺的LC50,明确了四聚乙醛对福寿螺的毒力与时间的关系;探讨了亚致死浓度的四聚乙醛短期处理对福寿螺AchE、GSTs和MFO活性的影响。

研究认为AchE由突触前膜释放,降解神经递质乙酰胆碱,终止信号对突触后膜的刺激,以维持正常信号传递,且发现在神经系统以外部位也存在[23]。在亚致死浓度的胁迫下,乙酰胆碱酯酶活力在福寿螺鳃和腹足内先上升后下降,肝脏和肠内AchE活力则是先降低再升高。说明四聚乙醛能够诱导肌肉内乙酰胆碱酯酶的活性增加,引起福寿螺突触内乙酰胆碱的降解,阻断或降低神经脉冲的传导。肌肉组织的麻痹引起消化器官活力下降,从而消化系统中乙酰胆碱酯酶活力降低,使得突触释放的乙酰胆碱积累,消化系统功能受损。据此推测,四聚乙醛胁迫可能导致腹足与鳃组织麻痹以及消化系统损伤从而引起福寿螺进入短期休眠状态。

四聚乙醛胁迫下,福寿螺机体除肝组织外,鳃、肠和腹足内GSTs活性均呈现为“降低—升高—降低”的趋势。这种时间效应与亚致死浓度氟胺氰菊酯对中华蜜蜂AchE活力的影响十分相似,靳三省[24]研究认为这种趋势是由农药在代谢过程中产生的次级代谢产物所引起的。GSTs在生物降解代谢第二阶段中参与脂溶性有机物的代谢和抵御氧化压力的胁迫[25]。本研究中四聚乙醛处理初期抑制了福寿螺GSTs活性,但是随着处理时间延长,可能其次级代谢产物的产生诱导了GSTs的表达,从而导致其活性升高[25]。GSTs活力的第二次降低可能是由于随着处理时间延长而引起机体损伤或福寿螺在受到药物胁迫作用下进入休眠状态,从而影响酶的活性,具体机制有待进一步深入研究。

细胞色素P450是MFO的重要组分[12],是生物体内广泛存在的一类代谢酶系,种类众多,起着末端氧化酶的作用[26],在内源和外源性物质的代谢,尤其是杀虫剂的代谢中起着重要作用[27]。四聚乙醛处理后福寿螺肝、鳃和肠组织内MFO酶活性呈现先降低后升高的趋势,说明MFO酶很可能也参与了对四聚乙醛的代谢。

本研究表明,福寿螺不同组织中AchE、GSTs和MFO酶的活力存在显著差异;亚致死浓度的四聚乙醛处理后24 h内不同组织中AchE、GSTs和MFO酶活力存在不同变化趋势,推测对AchE活性的影响可能与其进入休眠状态有关;而药物处理对GSTs和MFO的影响说明这两种酶可能参与了对四聚乙醛的解毒代谢。本试验只测定短期胁迫下四聚乙醛对AchE、GST和MFO酶活力影响,但这三种酶是否在福寿螺耐药性中起作用,还需要进一步系统研究。

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(责任编辑:田 喆)

Effects of sublethal dose of metaldehyde on the activities of AchE,GSTs and MFO inPomaceacanaliculata

Zhang Wenling1,2, Mu Xidong1, Wei Hui1, Yang Yexin1, Xu Meng1, Luo Du1, Hu Yinchang1

(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture,Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China;2. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To explore the sublethal effect of metaldehyde exposure on main target enzymes and detoxification enzymes inPomaceacanaliculata, the activity dynamics of AchE, GSTs and MFO were measured under sublethal concentrations of metaldehyde. The results showed that metaldehyde could significantly killP.canaliculata, and 96 h LC50and the safe concentration were 3.856 mg/L and 0.039 mg/L, respectively. Under 0.50 mg/L metaldehyde stress, AchE enzyme activity in gills and pleopod increased to 1.565 and 1.481 times as that of the control group, respectively, while the AchE activity in liver and intestine decreased to 0.132 and 0.282 times as that of the control group, respectively, but increased subsequently. GSTs activities were presented as a trend of “decrease-increase-decrease”; MFO activities decreased at the beginning and then were induced to increase to different extents. The results indicated that the activities of AchE, MFO and GSTs were induced to enhance to some extent during metaldehyde metabolism, and MFO and GSTs might play important roles in metaldehyde metabolism.

metaldehyde;Pomaceacanaliculata; sublethal effect; detoxification enzyme

2016-01-26

2016-03-31

国家自然科学基金(31300468)；农业部农业入侵防治项目(2130108)

S 482.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.008

* 通信作者 E-mail:huyc2@163.com