罗 丹，尹小平，王安东,3，田延河,梁 臻,巴 特,张江国



中哈边境口岸臀突客蚤检出立克次氏体核酸

罗 丹1，尹小平2，王安东2,3，田延河2,梁 臻2,巴 特2,张江国2

目的 了解中哈边境地区臀突客蚤(Xenopsyllaminax)中立克次氏体携带情况。方法 收集阿拉山口口岸臀突客蚤样本，PCR扩增立克次体17 kDa基因片段，PCR产物测序并BLAST比对，利用Mega 6.0构建分子遗传进化树。结果 42.86%(3/7)的臀突客蚤携带立克次体，17 kDa基因遗传进化树显示与CandidatusRickettsiasenegalensis和Rickettsiabellii同源性最高。结论 中哈边境口岸地区臀突客蚤携带立克次体核酸。

立克次体；臀突客蚤；PCR；中哈边境；序列分析

立克次氏体(Rickettsia)为革兰氏阴性菌，是专性细胞内寄生物，主要寄生于节肢动物，可通过蚤、虱、蜱、螨传播。立克次体病是一类严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病，从病人分离出病原体以及从基因检测证据表明我国至少存在10种立克次体病[1]。蚤类是鼠疫、鼠源性斑疹伤寒等多种自然疫源性疾病的重要医学媒介，对人、畜的健康造成严重危害[2-3]。作为中世纪时传播黑死病(腺鼠疫)的主要媒介，蚤是造成当时欧洲1/4人口死亡的重要因素。臀突客蚤(X.minax)是准噶尔盆地西半部大沙鼠(Rhombomysopimus)体表的优势蚤种，寄生于多种啮齿类及野生动物体表，并可叮人吸血。国外分布于哈萨克斯坦巴尔喀什湖中南部等区域，可自然感染鼠疫[4]。我国不仅从大沙鼠及体表上而且从游离的臀突客蚤中检测到鼠疫杆菌，但臀突客蚤是否携带立克次氏体病原至今国内外尚未见任何报道。本研究选取中哈边境地区优势蚤种臀突客蚤，检测立克次体携带情况，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集 2015年在阿拉山口口岸城区、郊区、野外荒漠区设置14个监测点，利用吸蚤器和粘蚤纸采集游离蚤，动物体表采集法收集寄生于野鼠等动物体表寄生蚤。

1.2 DNA提取 经体式显微镜鉴定后，按照DNA提取说明书(DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN))提取蚤体DNA(20只/组)。将提取的DNA置于-20 ℃保存，备用。

1.3 蚤线粒体基因扩增与序列分析 使用 LCO1490、HCO2198和F-Leu、R-Lys分别扩增蚤体线粒体COI和COII基因[5](见表1)。对PCR扩增产物进行测序，测序序列登录NCBI进行Blast同源性比对。使用Mega 6.0构建系统进化树，分析阿拉山口口岸臀突客蚤线粒体COI和COII基因特征。

1.4 立克次体检测与系统进化树分析 参照Clare A报道[6]，巢式PCR扩增立克次体17-kDa基因(见表1)。选取PCR阳性产物送北京鼎国生物科技有限公司进行测序。对测序序列进行Blast同源性比对。利用Mega 6.0构建分子进化树，分析阿拉山口地区臀突客蚤感染立克次体的17-kDa基因特征。

表1 PCR扩增引物和反应条件
Tab.1 The primers and reaction condition of PCR

引物名称引物序列(5'-3')片段大小/bp预变性/℃,s变性/℃,s退火/℃,s延伸/℃,s循环数总延伸/℃,sLCO1490GGTCAACAAATCATA-AAGATATTGG68594,6094,4045,4072,603572,420HCO2198TAAACTTCAGGGTGAC-CAAAAAATCAF-LeuTCTAATATGGCAGATTAGT-GC72795,18094,3042,3072,153772,300R-LysGAGACCAGTACTT-GCTTTCAGTCATC17KD5GCTTTACAAAATTCTA-AAAACCATATA55095,30095,6058,6072,603572,30017KD3TGTCTATCAATTCACAACT-TGCCGTT17KD1GCTCTTGCAACTTCTATGTT43495,30095,3061,3072,303572,30017KD2CATTGTTCGTCAGGTTGGCG

2 结 果

2.1 样本采集结果 采集样本431只，在镜下观察初步鉴定为：臀突客蚤(见图1)，长吻角头蚤，秃病蚤指名亚种、猫栉首蚤指名亚种、印鼠客蚤、宽背纤蚤和修长栉眼蚤指名亚种。其中臀突客蚤140只，长吻角头蚤61只，秃病蚤指名亚种21只，猫栉首蚤指名亚种75只，印鼠客蚤43只，宽背纤蚤55只，修长栉眼蚤指名亚种36只。

注：A雌 B雄图1 臀突客蚤Fig.1 X. minax(A:♀;B:♂)

2.2 PCR扩增结果 PCR扩增蚤线粒体COI和COII基因片段经电泳分析，分别在685 bp和727 bp处出现目的条带，与预期片段大小一致，见图2。

图A:蚤线粒体COI基因PCR扩增结果;图B: 蚤线粒体COII基因PCR扩增结果Fig A:The PCR product of COI gene from Siphonaptera;Fig B:The PCR product of COI gene from Siphonaptera图2 PCR扩增电泳图Fig.2 The PCR product of COI and COII from Siphonaptera

PCR扩增斑点热群立克次体17kD基因片段经电泳分析，在434 bp处出现目的条带，与预期片段大小一致，见图3。在7组臀突客蚤样本中，有3组检测到斑点热群立克次体核酸，阳性率为：42.86%(3/7)。

图3 斑点热群立克次体17 kD基因巢式PCR扩增结果Fig.3 The nest-PCR product of 17kD gene from SFGR

2.3 臀突客蚤线粒体基因序列分析：COI基因BLAST分析数据显示，ALSK056与ALSK067与西班牙X.cunicularis(KF479238) 具有89%(575/648)的同源性；与美国Xenopsyllaskrjabini(KM890983)具有96%(421/440)的同源性；与美国X.conformisconformis(KM890983)具有92%(404/440)的同源性；与美国Xenopsyllaconformismycerini(KM890903)具有91%(415/458)的同源性。分子遗传进化树显示：阿拉山口口岸臀突客蚤与其它客蚤属聚为一支，见图4。COII基因BLAST分析显示：ALSK056与与ALSK067与X.conformisconformis(KM890859)具有93%(630/678)的同源性；与西班牙X.conformismycerini(KM890770)具有92%(609/660)的同源性；与X.gratiosa(EU088169)具有89%(634/705)的同源性；与X.ramesis(KM890772)具有(585/649)的同源性。COII基因分子遗传进化树显示：阿拉山口口岸臀突客蚤可与其它客蚤属可汇聚为一支，见图5。

图4 臀突客蚤线粒体COI基因系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of X. minax mitochondrial cytochrome coxidase subunit I(COI)genes

图5 臀突客蚤线粒体COII基因系统进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of X. minax mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II(COII)genes

2.4 斑点热群立克次体17kD基因序列分析 BLAST分析显示：ALSK055与美国CandidatusRickettsiasenegalensis(KU167052)具有较高的同源性，同源性为：99%(374/377)，与美国RickettsiafelisURRWXCal2(CP000053)具有较高的同源性，同源性为：97%(386/395)； ALSK056和ALSK057与RickettsiabelliiOSU 85-389具有99%(403/405)的同源性。分子遗传进化树显示：ALSK055与CandidatusRickettsiasenegalensis和RickettsiafelisURRWXCal2聚为一支，ALSK056和ALSK067与RickettsiabelliiOSU 85-389，Rickettsia bellii isolate H3(KJ534308，巴西)聚为一支，见图6。

图6 立克次体17kDa基因系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Rickettsia 17kDa genes

3 讨 论

边境口岸地区快速识别蚤类标本，对防控蚤传疫病具有重要意义。由于蚤类个体非常微小，传统的形态学鉴定需要鉴定人员具备丰富的经验，容易造成误判，影响鉴定结果。随着分子生物学技术的快速发展，分子生物学技术逐步被应用到种类鉴定中。DNA条形码技术是通过一段几百碱基的标准化DNA分子序列进行物种识别鉴定的技术，近年来，该技术已被广泛应用于“隐存种”的发现，残缺标本的鉴定，宿主动物的识别等。本研究通过使用线粒体COI和COII两对基因对臀突客蚤进行分子生物学鉴定，由于GenBank中没有臀突客蚤的记录，所以与之匹配的同源性最高的均为客蚤属其他种。本研究首次在国际上报道了臀突客蚤的线粒体COI和COII基因序列。

随着分子生物学在细菌分类学中的应用，16S rRNA、17kDa、OmpA、Ompb等基因是常见的分类鉴定基因[7]。本研究使用立克次体17kDa基因对阿拉山口口岸地区蚤类携带立克次体进行检测，结果显示与CandidatusRickettsiasenegalensis和Rickettsiabellii同源性最高。SFGR是立克次体目中最复杂的一群立克次体，形态学差异不明显，用表型的方法进行种类鉴定是极其困难的, Fournier等提出了立克次体新种的鉴定分类标准，基于16S rRNA和4个蛋白编码基因gltA、ompA、ompB、geneD可以将立克次体分类鉴定到属、群、种的水平[8]。由于本研究尚未涉及对其他基因序列的分析，因此，仍不能准确的识别臀突客蚤所携带的立克次体，但经本研究可以证明：中哈边境阿拉山口口岸臀突客蚤携带立克次体核酸，可为后期立克次体的研究奠定基础。

臀突客蚤、印鼠客蚤、秃病蚤指名亚种和长吻角头蚤均为鼠疫的传播媒介，阿拉山口口岸地区于2005年在大沙鼠中检测到鼠疫杆菌，因此以上几种蚤暴露于鼠疫感染的高风险中。本研究又在臀突客蚤中检测到斑点热群立克次体核酸，我们推测：臀突客蚤在阿拉山口口岸地区鼠疫和立克次体传播中扮演主要角色。 阿拉山口口岸作为“一路一带”向西推进的桥头堡，增加了蚤和鼠等媒介生物随交通工具和货物输入我国的风险。为此，口岸相关部门应加强对出入境交通工具、货物中媒介生物的检测和消毒，严防外来生物和“外来病”的入侵。

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Yin Xiao-ping, Email:yxpciq@163.com

Rickettsia isolated fromXenopsyllaminaxat China-Kazakh border

LUO Dan1, YIN Xiao-ping2，WANG An-dong2,3, TIAN Yan-he2,LIANG Zhen2, BA Te2, ZHANG Jiang-guo2

(1CollegeofMedicine，ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2AlashankouEntry-ExitInspectionandQuarantineAuthorityAlashankou833418,China;3CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

In order to investigate the infection state ofRickettsiafromX.minaxat China-Kazakh border,theX.minaxwere collected,and 17 kDa genes ofRickettsiawere tested by PCR,and the sequence was analyed by BLAST and phylogenetic allysied by Mage 6.0. Showed that the positive rate of 17 kDa gene ofRickettsiawas 42.86% (3/7) at Alashankou Port. The phylogenetic tree ofRickettsia17 kDa gene showed that the unculturedRickettsiasp. was the highest homology withCandidatusRickettsiasenegalensisandR.bellii.In conclusion theX.minaxinfectedRickettsiaat China-Kazakh border.

Rickettsia；Xenopsyllaminax；PCR；China-Kazakh border；sequence analysis

国家自然基金(No. 81560338)和新疆维吾尔自治区自然科学基金(No.201442137-1)联合资助

尹小平，Email:yxpciq@163.com

1.新疆石河子大学医学院,石河子 832000；

2.新疆阿拉山口检验检疫局,阿拉山口 833418；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.014

R376

A

1002-2694(2016)08-0755-05

2016-02-14；

2016-03-24

3.新疆石河子大学动物科技学院,石河子 832000

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81560338) and Autonomous Region Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur (No. 2010J01115).