程琳?薛亚杰?袁红雨

摘 要：SSR分子标记是一种基于DNA重复序列长度多态性的分子标记技术，是进行群体遗传学结构分析、构建遗传连锁图谱非常有力的工具。应用该技术的前提条件是要有相应的SSR引物，可利用CTAB法提取茶树基因组DNA，对茶树基因组DNA进行MseI酶切连接获得目的基因，将目的基因进行PCR扩增后通过磁珠法洗脱，对产物进行测序，得到目的基因的序列组成。

关键词：茶树；SSR；分子标记；序列

真核生物基因组中含有一类DNA碱基序列，称作微卫星。微卫星DNA即简单序列重复（SSR，Simple Sequence Repeat），是一类由1～6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列。

本实验以PCR技术为基础，利用磁珠富集法获取开发茶树SSR分子标记序列所需的引物。

一、材料和方法

1.茶叶基因组DNA提取与检测

（1）取幼嫩的茶树叶片洗净，用70%乙醇消毒后再用无菌水冲洗，吸干水分，将材料放入研钵，加液氮研磨成粉末状。

（2）将粉末转移至2.0ml离心管中，放入刚才制作的预处理液1mL（0.4mol/L的葡萄糖，3%的聚乙烯吡烷酮），混匀后5000rpm离心，弃上清。

（3）向沉淀中加入630μL预热（65℃）1.5×CTAB提取缓冲液（1.5%CTAB，1.5mol/L NaCl，15mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.2%β-巯基乙醇），加入70μL无水乙醇，65℃水浴45min。

（4）从水浴中取出离心管，冷却后加入600μL氯仿：异戊醇（24∶1），混匀后10000rpm离心10min。

（5）将离心后的上清液转移至另一2mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇混匀，置于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心3min，弃上清。

（6）加入800μLTE buffer（10m mol/L Tris-HCl，1m mol/L EDTA，pH8.0），溶解DNA。

2.茶树基因组DNA的MseI酶切及电泳检测

取一个离心管向其中先后加入16.3μL ddH2O、0.2μL 100×BSA、1μL茶树基因组DNA、2.0μL 10×Buffer、0.5μL MseI（10U/μL），混匀后放至37℃水浴锅中反应三小时，然后65℃处理20min。

3.酶切产物与接头连接

取Oligo-MseI A和Oligo-MseI B分别配制成50μM贮存液，充分溶解后取出等体积Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各50μL充分混匀后94℃变性5 min，取出缓慢冷却至室温，保存于-20℃备用。……