廖秋林 张伟 彭大云 王蔚 张海燕 陈晓东

(广州军区广州总医院病理科，广东 广州 510010)

·论著·

应用iTRAQ技术筛选DNT差异表达蛋白

廖秋林 张伟 彭大云 王蔚 张海燕 陈晓东*

(广州军区广州总医院病理科，广东 广州 510010)

目的应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)筛选胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(DNT)差异表达蛋白。方法将DNT实体组织标本(2例)与正常脑组织标本(2例)，各组标本混合后提取蛋白，进行定量和酶解。iTRAQ标记后进行液相串联质谱分析。通过Mascot软件进行图谱分析。结果实验匹配到的谱图数量是82 300张，其中特有谱图数量为57 738张，共鉴定到2 663个蛋白，16 341个肽段，其中含14 993个特有肽段。当蛋白丰度差异倍数达到1.3倍以上，且经统计检验其P值小于0.05时，视为差异蛋白，共鉴定差异蛋白225个，其中48个蛋白上调，177个蛋白下调。结论通过iTRAQ技术分析得到的DNT差异表达蛋白可靠，iTRAQ技术为筛选出有意义的DNT生物标记物提供了一个良好的平台。

胚胎发育不良性神经上皮肿瘤; 蛋白质组学; 同位素标记相对和绝对定量技术; 生物标记物

胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(dysembryoplastic neuroepithelial tumor,DNT)是位于幕上的胶质神经元混合性肿瘤，主要发生在大脑皮质，WHO分级Ⅰ级，属于良性肿瘤。组织学上分为单纯型、复合型和非特异型3个亚型，后两者形态学与星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤有相似处，有时诊断十分困难。虽然近年来神经影像学和神经病理学取得了长足发展，但存在很大的挑战。DNT的发生过程可能包含细胞内多种信号通路的协同改变，能够研究这目前仍缺乏特异的DNT诊断标记物，病理医师在面对复杂型和非特异型DNT的诊断时的有效方法就是利用整体的方法认识和考虑这些复杂的改变。蛋白质组学可以通过对整体蛋白质的大规模分析研究生物过程相关蛋白质的表达和功能的改变。

同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ) 是2004年美国应用生物系统公司推出的一种利用同位素标签标记技术进行定量研究的蛋白质组学新兴技术，相对于其他蛋白质组学技术在定量可信度、覆盖度及定量精度方面都有明显的优势。本研究利用iTRAQ结合液相串联质谱 (liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS) 对DNT组织标本进行蛋白质组学分析，通过筛选DNT差异表达蛋白验证iTRAQ技术的可靠性并为发现DNT的生物标记物创造条件。

材料与方法

一、材料

选取广州军区广州总医院神经外科脑手术冻存标本，其中胚胎发育不良性神经上皮肿瘤2例，年龄18和25岁，男女各1例，以上述两例DNT旁的正常脑组织为对照。

二、方法

①蛋白质提取过程：称取适量的样品；②蛋白质浓度测量(采用Bradford定量)，依据标准曲线计算出样品浓度；③聚丙烯酰胺凝胶电泳；④蛋白质酶解；⑤iTRAQ标记；⑥用强阳离子交换色谱(strong cation exchange chromatography,SCX)进行液相分离；⑦液相串联质谱分析。

三、生物信息学分析

使用蛋白质鉴定软件Mascot2.3.02。操作时以mgf文件为原始文件，选择UniProt-Human (non-redundant 145 584 sequences)数据库，然后进行数据库搜索。

四、统计学分析

依据蛋白质丰度水平，当差异倍数达到1.3倍以上，且经统计检验其P值小于0.05时，视为差异蛋白。

结 果

一、蛋白质基本鉴定信息

鉴定出二级谱图总数373 984个，匹配到的谱图量82 300个，匹配到特有肽段的谱图数量57 738个，鉴定到的肽段的数量16 341个，鉴定到特有肽段序的数量14 993个，总共鉴定出蛋白质2 663个。这表明本实验采用的iTRAQ技术先进可靠，筛选出了大批量的肽段和蛋白质。

二、蛋白质定量

在相对定量时，如果同一个蛋白质的量在两个样品间没有显著的变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.3倍以上，且经统计检验其P值小于0.05时，视该蛋白为差异蛋白。对每个蛋白质差异倍数以2为底取对数后作出分布如下图(图1)。表达量上调的蛋白居于横坐标0位置的左侧(绿色)，表达量下调的蛋白居于横坐标0位置的右侧(红色)。DNT与正常脑组织标本比较，上调蛋白48个，下调蛋白177个。

图1 蛋白质丰度分布
Fig 1 Protein abundance distribution

三、差异蛋白的基因本体论(gene ontology,GO)富集分析

基因本体论是一套国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表(controlled vocabulary)来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个本体(ontology)，分别描述基因的分子功能(molecular function)、细胞组成(cellular component)、参与的生物过程(biological process)。我们针对鉴定出的所有差异蛋白进行GO功能注释分析，从而给出差异蛋白质与哪些生物学功能显著相关。本实验鉴定出的上调蛋白中涉及翻译延伸因子，rRNA连接素、碳水化合物衍生结合素、ATP:ADP反向转运体、枸橼酸盐跨膜转运体、三羧酸跨膜转运体、DNA结合、单链RNA结合、氨基葡聚糖、调理素、髓鞘结构成分、肝磷脂、血小板衍生生长因子、翻译调整、有机酸跨膜转运蛋白、羧酸跨膜转运、翻译因子、三价铁、多聚尿苷酸RNA、血管紧张素受体Ⅰ型、多巴胺受体、NAD结合蛋白、酶结蛋白、有机负跨膜离子转运蛋白、序列特异性DNA结合蛋白、原肌球蛋白、泛醇细胞色素-c还原酶、多聚密定二氮三烯陆环通道、联苯芬及相关物质氧化还原酶、脱乙酰基酶、血管紧张素受体等多种生物学功能。

四、差异蛋白的通路(pathway)富集分析

通路显著性富集分析方法同基因本体论功能富集分析，是以KEGG公共数据库里的代谢通路为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到蛋白背景相比，在差异蛋白中显著性富集的通路。通过通路显著性富集分析确定这些差异蛋白参与组蛋白代谢、剪接体、细胞色素P450药物代谢、人T细胞白血病病毒感染、抗原加工及传递、类固醇激素合成、脂肪酸延长、细胞周期等多种代谢及信号通道。

讨 论

本实验采用iTRAQ技术，是目前较先进和可靠的高通量蛋白质定量鉴定技术。质谱仪器采用Q-Exactive，该仪器的优势在于具有很高的分辨能力和质量精确度，可以广泛适用于小分子和大分子分析，尤其适合样品高度复杂的蛋白质组学研究领域。肽段母离子质量的精确测定可以显著减小假阳性鉴定结果的出现概率，因此鉴定质量可靠。

本研究共鉴定了中国大陆黄种人DNT相对于正常脑组织的差异蛋白质225个，其中上调蛋白质48个，下调蛋白质177个。上调蛋白具体包括肌球蛋白轻链可变区域，人类组蛋白1，甘油三磷酸脱氢酶，甘油甲酸酯反向转运体，S100A8，羟酰谷胱甘肽水解酶，髓鞘相关糖蛋白，铁蛋白轻链，肌动蛋白结合蛋白，天冬氨酸酰酶，可溶性家族转运蛋白9(钠/氢交换器)，髓磷脂碱性蛋白，WDR44，载脂蛋白D，S100A4，细胞色素b-c1复合亚单位7，核酸内切酶封闭领域1蛋白，β1微管蛋白，非常规肌球蛋白Id，巨大圆盘相关蛋白4，乳腺癌放大序列1，神经微丝重链多肽，半乳凝结蛋白3，凝血酶原，尿苷酸结合蛋白，肌肽合酶，细胞角蛋白10Ⅰ型，S100A9，乳铁蛋白，白鼬，S期激酶相关蛋白1，丙酮酸脱氢酶E1，磺基转移酶4A1，α球蛋白，中性粒细胞防卫素1，α血红素稳定蛋白，三联组氨酸核算结合蛋白1，细胞粘附分子4，热休克蛋白72，氯苄乙胺4，磷酸神经膜，二氢尿嘧啶脱氢酶依赖蛋白脱乙酰基酶2。

在上调的蛋白质中，NF蛋白及髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)是我们比较熟悉和常用的蛋白，已经在神经系统肿瘤常规应用，但缺乏特异性和敏感性。S100家族被视为重要的一群蛋白，与肿瘤细胞生长、浸润、转移过程中所发生的基因和分子变化，对临床诊治肿瘤有重要作用。本实验鉴定出S100A4、S100A8和S100A9三个家族成员。S100A4蛋白具有减少肿瘤细胞间黏附，促进细胞异常增生，促进细胞外基质降解和重塑增加肿瘤细胞运动性，促进肿瘤血管生成等作用[1]。S100A8可通过清除氧化物阻止过度氧化对机体的损伤，促进伤口愈合，表现为抗炎作用[2]。除炎症外，S100A8 在多种原发和浸润性肿瘤、多种自身免疫性疾病以及心血管疾病中发挥重要作用。 S100A9参与细胞分化、增殖、蛋白磷酸化、突变细胞的侵袭与转移等过程。已有研究发现，S100A9 在结肠癌、肺癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤组织的分化程度呈负相关[3～6]。髓鞘相关糖蛋白通过介导胶质细胞与轴突的相互作用参与髓鞘的形成及其完整性的维持，同时也是髓鞘来源的神经生长抑制因子的主要成分，在神经系统发育的不同阶段，显示不同的功能：即发育期促进轴突生长，成熟期抑制轴突生长[7]。微管蛋白是微管的组成成分，在细胞中起重要的细胞骨架作用。在神经系统，微管系统的稳定性也是维持胞体和突触间营养转运的基础。已证实微管蛋白与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的关键蛋白密切相关。乳铁蛋白是一种相对分子质量为80 kD的球状糖蛋白。目前已作为一种安全、有效、新型的脑靶向功能分子已备受人们的青睐，在肿瘤治疗领域中也显示了巨大的发展前景，但作为药物载体的稳定性、有效性和靶向性还应该持续探索[8,9]。防卫素最早发现并定名于1980年，属于肽(包括多肽)类物质，具有对抗、杀灭细菌，抗真菌、抗病毒、抑制细胞毒作用及溶胞作用。还可能在动脉粥样硬化患者的脑动脉内皮细胞和内层平滑肌细胞中发挥作用，有些防卫素具抑制细胞呼吸活动能力，或对细胞体积、趋化性和有丝分裂起调节作用，抑制天然杀伤细胞活动[10]。三联组氨酸核苷酸结合蛋白1(histidine triad nucleotide-binding protein 1,HINT1)广泛参与肿瘤、神经精神疾病等人类疾病的病理生理过程，在中枢神经系统广泛表达，探讨其酶活性、肿瘤抑制、神经病理之间的内在联系是一个重要的研究方向[11]。氯苄乙胺(septin)蛋白是一系列分子量在30～65 ku之间，并在结构上比较保守的蛋白家族。最早的septin 蛋白是在酵母中发现的，随后发现在其他真核生物体内，如真菌、哺乳动物等也广泛存在着septin蛋白家族。随着研究的不断深入，发现其在人体内的作用越来越突出，参与了细胞分裂、物质运输和细胞凋亡等重要过程，并与人类多种疾病有着重要关系，尤其是与多种中枢神经系统疾病关系密切[12]。

有意思的是，鉴定出上调蛋白48个，而下调蛋白177个，宏观上说明DNT较正常脑组织代谢有降低，合成的多达177种蛋白的数量减低，更倾向发育不良，所以是一种特殊的神经上皮肿瘤，预后较好，与神经上皮恶性变有本质上的不同。

基于iTRAQ技术的蛋白质组学研究为脑肿瘤尤其是与发育不良相关的肿瘤提供了广泛而实用的分子生物学信息。本文对DNT相对于正常脑组织的差异蛋白做了一个全面筛选实验，鉴定出了225种差异蛋白，但对这些蛋白在DNT发生发展中的具体病理生理机制，其生物学功能及参与的信号通路对DNT的具体影响机制仍有待进一步研究。对备选的生物标记物的特异性仍有待进一步的实验验证。

1Mazzuccheli L. Protein S100A4:too long overlooked by pathologists [J]. Am J Pathol,2002,160(1):7-13.

2李红梅,郑晶,黄劲. 钙结合蛋白S100A8在内毒素休克小鼠肝脏中的表达 [J]. 现代预防医学,2011,38(15) :3085-3086.

3Arai K,Teratani T,Nozawa R,et al. Immunohistochemical investigation of S100A9 expression in pulmonary adenocarcinoma:S100A9 expression is associated with tumor differentiation [J]. Oncol Rep,2001,8(3):591-596.

4Jungblut PR,Zimny-Arndt U,Zeindl-Eberhart E,et al. Proteomics in human disease:cancer,heart and infectious diseases [J]. Electrophoresis,1999,20(10):2100-2110.

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7顾文莉,陆佩华. 髓鞘相关糖蛋白与神经系统的髓鞘发育和轴突生长 [J]. 生理科学进展,2006,37(3):243-246.

8Tuccari G,Barresi G. Lactoferrin in human tumours:immunohistochemical investigations during more than 25 years [J]. Biometals,2011,24 (5):775-784.

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11党永辉,刘仲伟,陈峰,等. 三联组氨酸核苷酸结合蛋白1与人类疾病 [J]. 中国医学科学院学报,2014,36(4):454-460.

12吴继军,韩卫星. 人类septin蛋白家族及其与疾病关系的研究进展 [J]. 安徽医科大学学报,2013,48(10):1281-1284.

ApplicationofiTRAQtechnologyinscreeningdifferentiallyexpressedproteinsofdysembryoplasticneuroepithelialtumor

LIAOQiulin,ZHANGWei,PENGDayun,WANGWei,ZHANGHaiyan,CHENXiaodong

DepartmentofPathology,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China

ObjectiveTo screen differentially expressed proteins of dysembryoplastic neuroepithelial tumor (DNT) by the proteomics analysis using isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS /MS).MethodsThe patients were classified in 2 groups:DNT (n=2) and normal brain tissue (n=2). After quantification and enzymolysis of the protein extract from the admix specimens of the two groups,the iTRAQ regents 113 and 117 were used to label the peptides of the two groups,respectively. Then，the mixture of the peptides was analyzed by 2D-LC-MS /MS. The MS data were searched against the International UniProt-Human using the Mascot2.3.02 for peptide identification and quantification.ResultsA total of 2663 proteins were identified from the International UniProt-Human. Based on the condition of screening differentially expressed proteins,comparing with normal brain tissue,48 proteins were significantly up-regulated (gt;1.3-fold) and 177 were significantly down-regulated.ConclusionThe differentially expressed proteins of DNT identified by proteomic analysis using iTRAQ are reliable. The iTRAQ technology provides a good platform to identify more significant biomarkers of DNT.

Dysembryoplastic neuroepithelial tumor (DNT); Proteomics; Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ); Biomarker

1671-2897(2016)15-506-04

R 739

A

广东省科技计划基金资助项目(2012B031800177)

廖秋林，主治医师，E-mail:lin_success@126.com

*通讯作者：陈晓东，主任医师，E-mail:cxdong1966@yahoo.com.cn

2015-08-16；

2015-10-18)