阿得力·艾山



三七总皂苷对心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表达的影响

阿得力·艾山

目的 探讨三七总皂苷对心肌梗死大鼠血管新生及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 成年健康Wistar大鼠108只，随机分为对照组、三七总皂苷低剂量组和高剂量组，各36只。采用左冠状动脉结扎法建立急性心肌梗死大鼠模型。模型建立后对照组给予生理盐水100 mg/kg腹腔注射；三七总皂苷低、高剂量组分别给予100 mg/kg和400 mg/kg三七总皂苷腹腔注射，每日一次。分别于术后3 d，7 d，14 d 和21 d处死大鼠9只，检测各组大鼠心肌梗死周边组织微血管密度、心肌梗死面积百分比、心肌梗死周围组织VEGF mRNA表达水平，分析微血管密度与VEGF mRNA的相关性。结果 3组大鼠心肌梗死周边组织微血管密度逐渐增加，低剂量组和高剂量组各时点心肌梗死周边组织微血管密度显著高于对照组(P<0.05)；而高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)；3组大鼠各时点心肌梗死面积百分比差别有统计学意义，高低剂量组显著低于对照组(P<0.05)；而低剂量组和高剂量组差别无统计学意义(P>0.05)；对照组大鼠心肌梗死周围组织VEGF mRNA表达呈现先增高后降低的趋势；高低剂量组大鼠VEGF mRNA表达随时间推移显著增高；各时点高剂量组VEGF mRNA表达水平显著高于对照组和低剂量组(P<0.05)，低剂量组显著高于对照组(P<0.05)；3组大鼠心肌梗死周围组织血管密度与VEGF mRNA均呈现正相关(r对照组=0.86，r低剂量组=0.84，r高剂量组=0.86，P<0.05)。结论 三七总皂苷通过上调VEGF表达促进新生血管生成，减少了心肌梗死面积。

心肌梗死；三七总皂苷； 血管内皮生长因子；血管密度；血管新生；大鼠

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是临床上最为常见的心血管疾病之一[1]。近年来随着我国人口老龄化的加剧以及生活饮食习惯的逐渐改变，AMI的发病率出现了逐年上升的趋势[2]。随着医疗水平的不断进步，急性心肌梗死后再血管化治疗取得了较大的进展，使得病人心功能得到明显改善，生活质量显著提高。但存在冠状动脉弥漫性病变的病人大多丧失了再血管化治疗的机会，预后较差。因此，如何促进梗死后新生血管生成成为了研究热点[3]。中药提取物三七总皂苷具有活血祛瘀，通脉活络，抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用。近年来的研究显示，三七总皂苷还具有促进新生血管生成的作用，但其确切分子机制并不十分清楚[4]。本研究采用Wistar大鼠为研究对象，建立AMI模型，探讨三七总皂苷对心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表达的影响，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂仪器 成年健康Wistar大鼠(购自新疆医科大学实验动物中心)体重180 g～220 g，(3～4)月龄，饲养于安静动物房，恒定温度为20 ℃～22 ℃，湿度为50%，12 h光暗周期。三七总皂苷购自云南省药物研究所制药厂；组织标本RNA提取试剂盒，购自大连宝生生物公司；VEGF引物序列，由华大基因公司合成；SP免疫组化试剂盒及抗鼠Ⅷ多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。7900HT Realtime PCR仪，购自美国ABI公司；多功能酶标仪，购自德国Berthold公司；石蜡切片机，购自德国徕卡公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 成年健康Wistar大鼠108只随机分为对照组、三七总皂苷低剂量组和高剂量组各36只。采用左冠状动脉结扎法建立急性心肌梗死大鼠模型。大鼠用10%水合氯醛麻醉后，与左侧3、4肋切口打开胸腔，切开心包暴露冠状动脉，在动脉圆锥与左心耳下1 mm处分离并结扎左侧冠状动脉后逐层关闭胸腔。模型建立后对照组给予生理盐水100 mg/kg腹腔注射；三七总皂苷低、高剂量组分别给予100 mg/kg和400 mg/kg三七总皂苷腹腔注射，每日一次。分别于术后3 d，7 d，14 d 和21 d处死大鼠9只，检测各组大鼠心肌梗死周边组织微血管密度、心肌梗死面积百分比、心肌梗死周围组织VEGF mRNA表达水平，分析微血管密度与VEGF mRNA的相关性。

1.2.2 微血管密度检测 在各时间点断颈法处死大鼠后，将大鼠心脏取出制成石蜡切片，以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体进行免疫组化染色，计数梗死区微血管数目。每张切片随机选取5个高倍视野，计算后取平均值。

1.2.3 VEGF mRNA检测 根据RNA提取试剂盒说明，提取大鼠心脏组织总RNA，并逆转为cDNA 后应用7900HT Realtime PCR仪检测大鼠VEGF mRNA表达水平。VEGF上游引物F：5′-agaaggaggagggcagaatca-3′下游引物R：5′-caaatgctttctccgctctga-3′。反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃30 s，52℃30 s，72℃60 s，共40个循环；72 ℃ 10 min。

2 结 果

2.1 微血管密度比较 3组大鼠心肌梗死周边组织微血管密度逐渐增加，低剂量组和高剂量组各时点心肌梗死周边组织微血管密度显著高于对照组，且差别有统计学意义(P<0.05)；而高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠心肌梗死周边组织微血管密度比较(±s)

2.2 心肌梗死面积比较 3组大鼠各时点心肌梗死面积百分比差别有统计学意义，高剂量组、低剂量组显著低于对照组(P<0.05)；而低剂量组和高剂量组差别无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 3组大鼠心肌梗死面积比较(±s) %

2.3 心肌VEGF mRNA表达比较 对照组大鼠心肌梗死周围组织VEGF mRNA表达先增高后降低的趋势；高、低剂量组大鼠VEGF mRNA表达随时间推移显著增高；各时点高剂量组VEGF mRNA表达水平显著高于对照组和低剂量组(P<0.05)，低剂量组显著高于对照组(P<0.05)。详见表3。

表3 3组大鼠心肌梗死周围组织VEGF mRNA表达比较(±s)

2.4 VEGF mRNA与血管密度关系 3组大鼠心肌梗死周围组织血管密度与VEGF mRNA均呈现正相关(r对照组=0.86，r低剂量组=0.84，r高剂量组=0.86，P<0.05)。详见图1。

图1 3组大鼠周围组织血管密度与VEGF mRNA相关性

3 讨 论

急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。近年来AMI已发展成为城镇居民高发的心血管疾病。临床上病人主要表现为剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图改变。目前对于AMI治疗的有效方法为经皮冠状动脉成形术或冠状动脉旁路移植术，此治疗方法疗效确切，能够挽救濒死的心肌细胞，提高病人生活质量，降低AMI病人死亡风险[5]。但对于直径小于2 mm的病变血管无法采用上述方案进行治疗。对于小于2 mm的冠脉血管病变导致的局部缺血性病变可以采用促进缺血区血管新生的方法来再建立血液循环，保留心肌功能。有研究显示某些细胞生长因子可刺激缺血的心肌组织形成新生血管并再通，为濒临死亡的心肌细胞提供营养[6]。这类细胞因子中，血管内皮生长因子具有较强的促血管生成作用，VEGF是血管内皮细胞特异性促有丝分裂原，是目前为止最为特异的促进新生血管形成的生长因子[7]。大量动物实验证实，VEGF能够诱导缺血缺氧心肌组织产生功能性新生血管，建立新的侧支循环，改善心肌血液供应[8]。

除了VEGF外，近年来有研究发现一些中药成分同样能够促进新生血管生成。三七总皂苷为中药三七中提取的生物活性成分，包括有人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，三七皂苷R1等[9]。临床上具有活血祛瘀，通脉活络，具有抑制血小板聚集和增加心脑血流量的作用。新近的动物实验显示，三七总皂苷可促进缺血性心肌组织微循环建立，诱导新生血管生成，但其确切分子机制不明[4]。

本研究采用Wistar大鼠制作AMI模型，探讨三七总皂苷对心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表达的影响，明确其促进新生血管的分子机制。研究结果显示三七总皂苷可显著提高AMI大鼠梗死心肌周围微血管密度，降低梗死心肌面积，提高心肌VEGF mRNA表达水平，且大鼠心肌梗死周围组织血管密度与VEGF mRNA均呈现正相关。

本研究证实三七总皂苷可能通过上调VEGF表达促进新生血管生成，减少心肌梗死面积，改善大鼠心功能，挽救濒死的心肌细胞。但三七总皂苷通过何种分子机制和信号通路上调VEGF表达仍不十分清楚。因此，下一步应采用相关分子生物学实验，进一步探讨其调控VEGG表达的分子机制，为三七总皂苷的临床应用提供理论依据。

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(本文编辑王雅洁)

新疆医科大学第一附属医院(乌鲁木齐 830054)，E-mail：zhengyi50324@126.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.011

1672-1349(2016)15-1732-04

2015-09-28)