王程，王丽丽，纪朋艳，刘玉莲，李妍，张巍，隋春红

（1.吉林医药学院 基础医学院，吉林吉林132013；2.吉林医药学院 药学院，吉林吉林132013）

硒化高粱蛋白质的制备及其抗氧化活性

王程1，王丽丽1，纪朋艳1，刘玉莲1，李妍1，张巍1，隋春红2，*

（1.吉林医药学院 基础医学院，吉林吉林132013；2.吉林医药学院 药学院，吉林吉林132013）

采用化学修饰法将高粱蛋白质（SP）制备成硒化高粱蛋白质（Se-SP）并鉴定其抗氧化活性。结果表明，各种Se-SP均表现出一定的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力，其中Se-SP23的活力最高，为227U/g蛋白。各种Se-SP均还可发挥清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羟自由基（·OH）和超氧阴离子（O2-·）等自由基的作用，并可有效降低抗坏血酸/二价铁离子（VC/Fe2+）诱导损伤线粒体中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的产生，维持心肌线粒体的形态，抑制损伤线粒体的膨胀。

高粱蛋白；硒；抗氧化活性

必需微量元素硒（selenium，Se）对健康至关重要，因其具有较强的抗氧化效应，在预治肿瘤、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等多种疾病过程中发挥重要作用［1］。人体中的Se主要来源于植物硒蛋白质，并主要以硒代甲硫氨酸（selenomethionine，Se-Met）和硒代半胱氨酸（selenocysteine，Se-Cys）的形式存在［2-3］。植物蛋白质是蛋白质资源的巨大宝库，积极开发植物蛋白质资源具有战略意义。高粱是人类栽培的主要粮食作物之一，且高粱蛋白质（sorghum protein，SP）占高粱种子总重的6.8%～19.6%［4］，其中77%～82%为醇溶蛋白质［5］。SP因其较强的抗氧化性而具有抑菌、保鲜等重要作用一直受到广泛关注［6］。同时，化学修饰法制备硒蛋白质技术已基本成熟，即在相对温和的条件下（温度在20℃以上即可进行反应［7］），用Se原子取代蛋白质分子中丝氨酸（serine，Ser）羟基（hydroxyl，-OH）中的氧（oxygen，O）原子，使Ser转变为具有硒氢基（selenyl，-SeH）的Se-Cys，从而制备含硒多肽或含硒蛋白质［8］。如能采用化学修饰法制备大量的硒化高粱蛋白质（se lenide sorghum protein，Se-SP），在检验其安全性后应用于医疗保健方面，具有重要的社会意义和经济效益。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

东北有机高粱米：吉林永鹏农副产品开发有限公司（蛋白质含量10.4%）；牛心：吉林东清真寺屠宰场；植物蛋白质提取试剂盒：上海贝博生物技术有限公司；Sephadex G-25：Pharmacia公司；透析袋 3500：Spectium公司；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；蛋白质分子量标准：Transgen公司；牛血清白蛋白质（BSA）、硒粉、依布硒（Ebselen）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、抗坏血酸（VC）、硫代巴比妥酸（TBA）：Sigma公司；硒标准液：国家标准物质研究中心；硼氢化钠（NaBH4）、过氧化氢（H2O2）、硫酸亚铁（FeSO4）：国药集团化学试剂有限公司。

高速粉碎机：上海顶帅电器有限公司；HD-4核酸蛋白质检测仪：上海沪西分析仪器厂；FD-1C-50型冷冻干燥机：比朗（上海）仪器有限公司；UV-2550紫外分光光度计，AA-6300型原子吸收分光光度计，Se空心阴极灯：日本岛津公司；AFS-230E型双道原子荧光光度计：北京海光仪器公司；LDI-1700基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）：美国Linear Scientific公司。

1.2试验方法

1.2.1SP的提取

将高粱种子置于60℃烘箱至恒重，磨粉后过80目筛。利用植物蛋白质提取试剂盒提取SP，冻干后即为SP。Lowry法［9］测定蛋白质含量，蛋白质提取率/%=提取的蛋白质质量（g）/高粱原料中蛋白质质量（g）× 100。

1.2.2SP组分的分离与分子量测定

采用Suphedex G-25凝胶层析分离SP各组分，SP各组分冻干备用。用pH=7.5的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）将各组分SP重新溶解，进行SDSPAGE（5%浓缩胶、15%分离胶）鉴定［10］，MALDI-TOFMS测定SP分子量［11］。

1.2.3SP的化学修饰

按Klaymen［12］方法在氮气保护下制备1mol/LNaHSe。用50 mmol/L PBS（pH=7.4）将纯度大于75%的SP溶解成浓度为0.25g/L的蛋白质溶液，每1毫升SP溶液加入12.5 μL PMSF（20 g/L乙腈溶液），密闭容器中25℃水浴3 h，再通入高纯度氮气20 min将体系内氧气完全排除后加入15 μLNaHSe溶液，氮气保护下37℃反应40 h，反应完成后将溶液置于空气中4 h充分氧化，12 000 r/min离心20 min除去沉淀，蒸馏水透析3次除盐，冻干后即得Se-SP。

1.2.4SP和Se-SP硒含量和GPX活力的测定

SP和Se-SP的硒含量采用氢化物原子荧光光谱法检测［13］。SP和Se-SP的谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）活力采用Wilson的酶偶联法测定［14］，酶活力定义为1 min内氧化1 μmol/L NADPH所需要的酶量为1 U，比活力的单位为U/g。

1.2.5Se-SP清除自由基能力的测定

配制不同浓度梯度的Se-SP样品（12.5、25、27.5、50 mg/L）和Ebselen样品（2.5、5.0、7.5、10 μmol/L）［15］。以Ebselen为对照，按常规方法［16］分别测定Se-SP对DPPH·、羟自由基（hydroxyl radical，·OH）和超氧阴离子（superoxide anion radical，O2-·）的清除率。

1.2.6Se-SP对线粒体损伤保护作用的测定

差速离心法制备牛心线粒体［17］。以BSA为标准，考马斯亮蓝法测定线粒体浓度［18］。配制终浓度0.5 g/L的线粒体溶液。37℃保温30 min后，加入终浓度为0.5 mmol/L VC和12.5 μmol/L FeSO4，即为线粒体损伤模型。模型建立后立即加入各待测样品（各组分Se-SP、SP样品的终浓度为50 mg/L，Ebselen样品的终浓度为10 μmol/L），37℃振荡并计时。分别以正常线粒体（未进行模型损伤）和损伤线粒体为对照，在0、5、10、15、20、30、40、50 min时间点测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，在0、2、4、6、8、10、15、20 min时间点测定线粒体膨胀度。损伤线粒体产生的MDA含量采用TBA法测定［19］。线粒体膨胀度是通过测定溶液在520 nm波长下的吸光度值的变化来判定，线粒体膨胀度与A520值成反比［20］。

1.3数据处理

2　结果与分析

2.1SP的提取和分离鉴定

高粱种子原料的蛋白质含量为10.4%，采用植物蛋白质提取试剂盒可从100 g高粱种子中提取（6.13± 0.26）g SP，提取率为58.9%。经Suphedex G-25凝胶层析，收集到4个分离组分，共包含6个蛋白质峰，见图1。

采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS对SP各组分所含主要蛋白质的分子量进行分析测定，结果检测到6种主要的SP，结果见图2和图3。

根据测定的分子量分别将其命名为SP16、SP23、SP28、SP45、SP46、SP49。其中SP23为α-醇溶蛋白质，SP16为β-醇溶蛋白质，SP28为γ-醇溶蛋白质，SP45、SP46、SP49为其它杂蛋白质［21］。

图1　高粱蛋白质的凝胶色谱洗脱曲线Fig.1　Elution curve of SP using gel chromatography

图2　高粱蛋白质的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of SPs

图3　高粱蛋白质的MALDI-TOF-MS分析Fig.3　MALDI-TOF MS analysis of SPs

2.2SP和Se-SP的硒含量和GPX活力

研究中常以机体内重要含硒酶GPX的活力作为衡量硒蛋白质抗氧化活力的指标［22］。各组分SP和Se-SP的硒含量和GPX活力，以及蛋白质纯化、硒化后Se-SP的回收率和纯度见表1。

表1　各组分高粱蛋白和硒化高粱蛋白的理化性质和抗氧化酶活性Table 1　Physical and chemical properties and antioxidant enzyme activities of SPs and Se-SPs

结果发现，提取的SP并不具有GPX活力，但硒化修饰的Se-SP表现出明显的GPX活力，其中Se-SP23的活力最高。这说明SP产生GPX活性的关键是Se的掺入。通过Se-SP硒含量与其GPX活力对比分析发现，Se-SP的GPX活力大小与蛋白质的硒含量并没有明显的量效关系，这说明硒蛋白质的GPX活力不仅与硒含量有关，还可能与硒蛋白的空间结构密切相关［23］。

2.3SP和Se-SP对自由基的清除作用

分别检测了 SP16、Se-SP16、SP23、Se-SP23、SP28、Se-SP28对DPPH·、·OH和O2-·的清除作用。结果发现，各种Se-SP对DPPH·的清除作用较对应的SP增强了1.7倍～2.6倍，其中Se-SP23的清除效果最佳，其清除率比阳性对照Ebselen（对应浓度的Se-SP24和Ebselen所具有的GPX活力相当）还高1.1倍，结果见图4。

各种Se-SP对·OH的清除作用较对应的SP增强了2.1～3.5倍，其中Se-SP23的清除率较高，与Ebselen相近，结果见图5。各种Se-SP对O2-·的清除作用较对应的SP增强了2.3倍～3.9倍，而且3种Se-SP均高于Ebselen，结果见图6。

图5　不同物质对OH·的清除作用Fig.5　Scavenging effects of different chemicals on the OH·

图6　不同物质对O2-·的清除作用Fig.6　Scavenging effects of different chemicals on the O2-·

上述结果说明Se-SP能有效清除DPPH·、·OH和O2-·。而作为阳性对照的有机硒化合物Ebselen仅对DPPH·、·OH发挥清除作用，这可能由于Ebselen仅能由-SeH提供的氢发生还原反应，缺乏空间结构优势，而Se-SP不仅由Se-Cys作为供氢体清除DPPH·、·OH，还可通过其空间结构螯合过渡金属离子促进O2-·分解［24］。

2.4SP和Se-SP对线粒体损伤的保护作用

通过鉴定Se-SP对VC/Fe2+诱导牛心线粒体损伤模型的保护作用，深入研究Se-SP在亚细胞水平的抗氧化活性。试验结果显示，SP和Se-SP均可以在一定程度上减少脂质过氧化产物MDA的产生，结果见图7。

图7　不同物质对损伤线粒体中MDA含量的抑制作用Fig.7　Inhibition effects of different chemicals on MDA content in damaged mitochondria

SP和Se-SP也均还可以抑制损伤线粒体的膨胀，从而保护线粒体，结果见图8。

图8　不同物质对线粒体膨胀的抑制作用Fig.8　Inhibition effects of different chemicals on swelling of mitochondria

同时发现，Se-SP对损伤线粒体的保护作用明显高于SP，其中Se-SP23的作用最强，可推测化学修饰后的Se-SP具有了可提供氢的化学基团-SeH，具有了较强是供氢能力和还原性，能更多中和活性氧成分，有效终止自由基链式反应，起到保护线粒体的目的。

3　结论

本研究成功采用Suphedex G-25凝胶层析将试剂盒提取的SP分离为4个组分，包含6种SP，又采用化学修饰法将其中3种纯度相对较高的SP28、SP23、SP16制备成Se-SP。采用这种方法可从100 g高粱种子原料中制备出约1 g的Se-SP，且该方法条件温和，操作简单，具备扩大生产潜力。试验鉴定各种Se-SP均具有一定的GPX活性，并能有效清除DPPH·、·OH和O2-·自由基，并有效减弱由VC/Fe2+诱导损伤的牛心线粒体的脂质过氧化反应，维持线粒体形态，抑制线粒体膨胀的发生。

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Preparation of Selenide Sorghum Proteins and Their Antioxidant Activity

WANG Cheng1，WANG Li-li1，JI Peng-yan1，LIU Yu-lian1，LI Yan1，ZHANG Wei1，SUI Chun-hong2，*
（1.School of Basic Medicine，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China；2.School of Pharmacy，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China）

Selenide sorghum proteins（Se-SPs）were prepared by chemically modified method，and their an－tioxidant activities were identified.The results showed that Se-SPs possessed certain antioxidant activity of glutathione peroxidase（GPX），Wherein，GPX activity of Se-SP23was highest，about 227 U/g protein.Se-SPs could play a scavenging role in free radical such as 1，1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine（DPPH·），hydroxyl radical（·OH）and superoxide anion（O2-·）.Moreover，Se-SPs could effectively decrease content of the lipid oxidation product MDA from damaged mitochondria induced by ascorbic acid/divalent iron ions（VC/Fe2+），and could be maintained in the cardiac mitochondrial morphology to avoid swelling.

sorghumprotein；selenium；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.002

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2015-405）

王程（1979—），男（汉），副教授，博士，主要从事食品抗氧化剂研究与开发。

隋春红，副教授，博士，研究方向：食品化学。

2016-05-15