王月华，付崇罗，张丽，玄红专

（聊城大学生命科学学院，山东聊城252059）

蜂胶及其提取物对3T3-L1前脂肪细胞增殖的作用

王月华，付崇罗，张丽，玄红专*

（聊城大学生命科学学院，山东聊城252059）

研究巴西蜂胶、中国蜂胶乙醇提取物，中国蜂胶乙酸乙酯及水提取物以及蜂胶中主要组分短叶松素、咖啡酸苄酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞的影响。采用正常培养的3T3-L1前脂肪细胞经不同浓度、不同提取方法得到的蜂胶及其主要组分分别处理24 h，倒置显微镜观察细胞形态，SRB法检测细胞存活率。蜂胶及其各种提取物抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖效果各不相同，中国蜂胶、中国蜂胶乙酸乙酯提取物、咖啡酸苯乙酯抑制增殖尤为明显。蜂胶及其主要组分抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。

蜂胶；中国蜂胶乙酸乙酯提取物；中国蜂胶水提物；3T3-L1细胞

蜂胶是西方蜜蜂从植物的树芽、树皮等部位采集的树脂并混入其上颚腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。根据蜂胶的植物来源，把世界不同地区的蜂胶大致分为六类，分别是：杨树型蜂胶、桦树型蜂胶、巴西绿胶、红胶、太平洋蜂胶以及加那利群岛蜂胶。尽管不同地区蜂胶化学成分相差很大，但目前研究表明，不同地区的蜂胶具有相似的生物学活性，如保肝［1］、抗菌［2-3］、抗炎［4］、抗肿瘤［5-7］、降血脂［8］、抑制血小板凝集［9］等，因而目前蜂胶广泛应用于保健品、食品及药品，用于增进健康，预防疾病［10］。

中国蜂胶属于杨树型蜂胶，其主要成分为酚酸类和黄酮类化合物。蜂胶难溶于水，易溶于有机溶剂。目前蜂胶研究主要以蜂胶的乙醇提取物，乙酸乙酯提取物以及水提取物为主，但是基于不同提取方法所得到的蜂胶提取物之间活性的比较研究较少，而且蜂胶是一种复合物，蜂胶里面至少含有300种以上的化学成分，目前关于蜂胶中功效成分的研究还较少。我们前期体内外试验均表明，蜂胶具有较好的降血脂功效［11-12］，但蜂胶降血脂，调节脂质异常的机理还不清楚，基于此，本试验通过比较中国蜂胶和巴西蜂胶乙醇提取物、中国蜂胶水提物和乙酸乙酯提取物以及蜂胶中主要组分如咖啡酸苯乙酯、咖啡酸苄酯、短叶松素、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的作用，初步研究蜂胶及其主要组分对前脂肪细胞的作用。

1　材料和方法

1.1材料

DMEM培养基：美国Gibco公司；胎牛血清：美国Hyclone公司；胰酶、磺酰罗丹明B（SRB）：美国Sigma公司；细胞培养皿、96孔板：美国Falcon公司；Tris：上海生工；其它试剂均为分析纯。

中国蜂胶采自山东省，主要植物来源为白杨属。巴西蜂胶为巴西绿胶，主要植物来源是克鲁西属。分别制备中国蜂胶乙醇提取物（EECP）、巴西蜂胶乙醇提取物（EEBP）、中国蜂胶水提物（WEP）、中国蜂胶乙酸乙酯提取物（EAEP）提取物。短叶松素、咖啡酸苯乙酯（CAPE）、咖啡酸苄酯、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素、木犀草素均从中国蜂胶中分离、提取，并经紫外（UV）和核磁共振（NMR）鉴定，纯度为98%以上。3T3-L1前脂肪细胞由聊城大学生命科学院细胞实验室保存。

1.2主要仪器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培养箱：力康生物医疗科技控股有限公司；TE2000S倒置荧光显微镜：日本Nikon公司；MK3酶标仪：芬兰雷勃公司；AR2140电子分析天平：美国奥豪斯公司；Milli-Q Synthesis超纯水：美国密理博公司。

1.3方法

1.3.1细胞的培养

3T3-L1前脂肪细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中，孵育条件为：5%CO2、37℃、饱和湿度CO2培养箱中。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.3.2细胞存活率的测定

将处于对数生长期的细胞按4 000个/孔种植到96孔板，37℃，5%CO2孵育，待3T3-L1前脂肪细胞长到80%以上，除正常组外所有处理组分别经不同浓度的中国蜂胶和巴西蜂胶乙醇提取物（12.5、25、50 μg/mL），中国蜂胶水提物和乙酸乙酯提取物（6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），CAPE和咖啡酸苄酯（2.5、5、10、20、40 μmol/L），短叶松素、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素（20、40、80 μmol/L）分别处理细胞24后，弃细胞培养液，用10%三氯乙酸4℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，100 mmol/L Tris碱溶解，在492 nm处测吸光值。

细胞存活率/%=（处理组OD值/对照组OD值）×100

1.4数据统计

采用SPSS v11.5软件包统计分析。计量资料以均数±标准差（x±S）表示，采用t检验进行统计学分析。P＜0.05为差异显著。

2　结果

2.1不同浓度的中国蜂胶和巴西蜂胶乙醇提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响

不同浓度的中国蜂胶和巴西蜂胶乙醇提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响见图1。

图1　不同浓度的中国蜂胶和巴西蜂胶乙醇提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响Fig.1　Effect of different concentrations of EECP and EEBP on cell viability of 3T3-L1 cells

由图1可以看出，EEBP对3T3-L1前脂肪细胞存活率影响不显著，而EECP随着浓度的升高显著抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖，EECP在浓度为50 μg/mL时对3T3-L1前脂肪细胞的抑制率为23%。

2.2不同浓度的中国蜂胶水提物和乙酸乙酯提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响

不同浓度的中国蜂胶水提物和乙酸乙酯提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响见图2。

图2　不同浓度的中国蜂胶水提物和乙酸乙酯提取物对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响Fig.2　Effect of different concentrations of WEP and ethyl acetate extract of proplis on cell viability of 3T3-L1 cells

由图2可以看出，中国蜂胶乙酸乙酯提取物和水提取物在浓度为6.25 μg/mL～12.5 μg/mL时对3T3-L1前脂肪细胞存活率影响不显著，但随着浓度的升高，显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，且具有浓度依赖性。此外，同浓度的乙酸乙酯提取物比水提取物更显著地抑制细胞增殖。

2.3不同浓度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸苄酯对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响

不同浓度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸苄酯对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响见图3。

图3　不同浓度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸苄酯对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响Fig.3　Effect of different concentrations of CAPE and caffeic acid benzyl ester on cell viability of 3T3-L1 cells

由图3可以看出，不同浓度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸苄酯在浓度大于5μmol/L时显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖，且具有剂量依赖性。

2.4不同浓度的短叶松素、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响

不同浓度的短叶松素、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响见图4。

图4　不同浓度的短叶松素、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞存活率的影响Fig.4　Effect of different concentrations of pinobanksin，apigenin，pinocembrin，chrysin，galangin and luteolin on cell viability of 3T3-L1 cells

由图4可以看出，短叶松素、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素和木犀草素在20 μmol/L时对3T3-L1前脂肪细胞的增殖作用影响不显著，随着浓度的升高对细胞的抑制作用显著增强。在80 μmol/L时，高良姜素对3T3-L1前脂肪细胞抑制率达到24%。

3　讨论

目前肥胖已成为危害人类健康的全球性健康问题，它与糖尿病、高血压、心脑血管疾病及肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关。如今，随着生活方式的改变，特别是高热量、高蛋白、高脂肪的摄入，肥胖的人越来越多，因此，开发和利用能增加基础代谢率，抑制体内脂肪合成，促进脂肪氧化，预防肥胖的功能性食品，对提高国民的生活质量，保护人体健康具有重要的意义。

在中医看来蜂胶是珍贵的天然药物，它含有600多种成分，是一个名副其实的小药库。它由动植物精华有机结合而成，性味平和、无毒副作用，可调节人体阴阳、气血平衡、“扶正祛邪”、防病治病［13-14］。蜂胶的基本成分是50%的树脂（黄酮和相关酚酸），30%的蜡和20%的其他成分［15］。中国蜂胶主要为酚酸类和黄酮类化合物，而巴西蜂胶主要为香豆酸类物质［16］。目前的结果表明，巴西蜂胶乙醇提取物对前脂肪细胞增殖影响不显著，而中国蜂胶乙醇提取物随着浓度的增加显著抑制前脂肪细胞的增殖。不同提取方法的中国蜂胶对前脂肪细胞的影响也不同，乙酸乙酯提取物的抑制功效较乙醇提取物和水提物更显著。此外，蜂胶中不同的组分对前脂肪细胞的影响不同，CAPE和咖啡酸苄酯对前脂肪细胞的抑制较其它黄酮类化合物更强，而且不同黄酮类化合物之间，高良姜素的抑制功效更强。由此可以看出，不同来源的蜂胶，同一来源不同提取方法的蜂胶以及蜂胶中不同的组分对前脂肪的影响均不同，需要进一步深入的研究。

［1］Basnet P，Matsushige K，Hase K，et al.Four di-O-caffeoyl quinic acid derivatives from propolis.Potent hepatoprotective activity in experimental liver injury models［J］.Biol Pharm Bull，1996，19（11）：1479-1484

［2］ Ivanovska ND，Dimov VB，Bankova VS，et al.Immunomodulatory action of propolis.VI.Influence of a water soluble derivative on complement activity in vivo［J］.J Ethnopharmacol，1995，47（3）：145-147

［3］El-Ghazaly MA，Khayyal MT.The use of aqueous propolis extract against radiation-induced damage［J］.Drugs Exp Clin Res，1995，21（6）：229-236

［4］Khayyal MT，el-Ghazaly MA，el-Khatib AS.Mechanisms involved in the antiinflammatory effect of propolis extract［J］.Drugs Exp Clin Res，1993，19（5）：197-203

［5］Orsolic N，Basic I.Immunomodulation by water-soluble derivative of propolis：a factor of antitumor reactivity［J］.J Ethnopharmacol，2003，84（2/3）：265-273

［6］Han S，Sung KH，Yim D，et al.Activation of murine macrophage cell line RAW 264.7 by Korean propolis［J］.Arch Pharm Res，2002，25（6）：895-902

［7］Suzuki I，Hayashi I，Takaki T，et al.Antitumor and anticytopenic effects of aqueous extracts of propolis in combination with chemotherapeuticagents［J］.CancerBiotherRadiopharm，2002，17（5）：553-562

［8］胡福良，詹耀锋，陈民利，等.蜂胶对高脂血症大鼠血液和肝脏脂质的影响［J］.浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（5）：510-514

［9］Serkedjieva J，Manolova N，Bankova V.Anti-influenza virus effect of some propolis constituents and their analogues（esters of substituted cinnamic acids）［J］.J Nat Prod，1992，55（3）：294-302

［10］Sun LP，Chen AL，Hung HC，et al.Chrysin：a histone deacetylase 8 inhibitor with anticancer activity and a suitable candidate for the standardization of Chinese propolis［J］.J Agric Food Chem，2012，60（47）：11748-11758

［11］Xuan H，Li Z，Fu C，et al.Propolis reduces phosphatidylcholinespecific phospholipase C activity and increasing annexin a7 level in oxidized LDL-stimulated human umbilical vein endothelial cells［J］. Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：465383

［12］Li Y，Chen M，Xuan H，et al.Effects of encapsulated propolis on blood glycemic control，lipid metabolism and insulin resistance in type2diabetes mellitus（T2DM）rats［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：981896

［13］Sforcin JM，Bankova V.Propolis：is there a potential for the development of new drugs［J］.J Ethnopharmacol，2011，133（2）：253-260

［14］Toreti VC，Sato HH，Pastore GM，et al.Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：697390

［15］Pietta PG，Gardana C，Pietta AM.Analytical methods for quality control of propolis［J］.Fitoterapia，2002，73（1）：7-20

［16］Sun LP，Chen AL，Hung HC，et al.Chrysin：a histone deacetylase 8 inhibitor with anticancer activity and a suitable candidate for the standardization of Chinese propolis［J］.J Agric Food Chem，2012，60（47）：11748-11758

The Proliferation Effect of Propolis and Its Extracts on 3T3-L1 Preadipocytes Cells

WANG Yue-hua，FU Chong-luo，ZHANG Li，XUAN Hong-zhuan*
（School of Life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China）

To study the effects of ethanol extract of Brazilian propolis（EEBP），ethanol extract of Chinese propolis（EECP），ethyl acetate extract of Chinese propolis（EAEP）and water extract of Chinese propolis（WEP）and the major constituents of propolis such as pinobanksin，caffeic acid benzyl ester，caffeic acid phenethyl ester（CAPE），apigenin，pinocembrin，chrysin，galangin and luteolin on 3T3-L1 preadipocytes cells.the normal cultured 3T3-L1 preadipocytes cells were treated with different concentrations of EEBP，EECP，EAEP，WEP and various constituents for 24 h，respectively.The cell viability was measured by SRB method.The inhibitory proliferation effects of propolis and its various constituents on 3T3-L1 cell were different，and EECP，EAEP and caffeic acid phenylethyl ester（CAPE）had a stronger inhibition activity on 3T3-L1 cells.Propolis and its major constituents inhibit the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes cells.

propolis；ethyl acetate extract of Chinese proplis；water extract of Chinese proplis；3T3-L1 preadipocytescells

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.001

国家自然科学基金（31201860）；聊城大学基金（31805，318011317）

王月华（1990—），女（汉），硕士生，研究方向：细胞生物学。*通信作者：玄红专（1978—），女（汉），副教授，博士。

2015-12-24