赵志浩+张定堃+吴明权+李春雨+曹丽娟+张萍+刘翠哲+王伽伯+肖小河

[摘要]附子是确有疗效的毒剧类中药，构建关联临床毒副反应的质量评价方法对提高其炮制减毒质控水平和保障临床安全性具有重要意义。该文针对附子可导致室性早搏这一早期心脏中毒反应，构建基于大鼠室性早搏（premature ventricular contractions，PVC）最小中毒量（minimal toxic dose，MTD）测定的附子炮制品质量生物评价方法，通过影响因素考察优化方法学（动物性别、体重、对照品稳定性与供试品稳定性），检测结果的重现性符合药品质量生物评价要求。应用该方法检测生附子及其不同炮制品黑顺片、白附片、蒸附片、刨附片、炮天雄致大鼠室性早搏MTD，结果表明，生附子炮制后MTD均显著升高（P<0.05），其中黑顺片、蒸附片、刨附片与白附片的MTD分别为生附子的15.76，22.36，19.65，20.97倍；而炮天雄几乎无毒，用该方法检测不出MTD。该方法可以比较好的反映附子及其炮制品的整体心脏毒性。进一步结合附子炮制品的化学成分分析，发现炮制品中双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱、次乌头碱，以及单酯型生物碱苯甲酰乌头原碱与PVC呈显著相关。此外，可能还存在其他与致心律失常相关的未测成分，值得深入研究。上述研究为附子临床早期心脏毒性评价与质量控制提供了整体、综合的方法，可作为化学评价方法的有益补充，为保障附子临床应用的安全性提供了新的方法。

[关键词]附子； 生物评价； 心脏毒性； 室性早搏； 最小中毒量； 质量控制

[Abstract]Aconiti Lateralis Radix （Fuzi） is a toxic traditional Chinese medicine with definite efficacy. In order to improve the quality control of its different prepared products and ensure the security in clinic， it is significant to establish a method of quality evaluation related to clinic adverse effects. Aiming at the important biological marker of early cardiac toxicity reaction， there was no method to detect it. In this manuscript， a novel approach for measuring the minimal toxic dose （MTD） of premature ventricular contractions （PVC） poisoning of rats was established. Then， the determination methodology and conditions were optimized to meet the needs of the quality and biological assessment， including animal sex， weight， stability of standards and test solutions. Using this method， the MTD value of different Fuzi products were determined， such as Heishunpian， Baifupian， Zhengfupian， Baofupian， and Paotianxiong. The results showed that the MTD of Fuzi was significantly decreased after detoxification processed （P<0.05） and the MTD of Heishunpian， Zhengfupian， Baofupian and Baifupian was as much as 15.76， 22.36， 19.65 and 20.97 times to that of unprocessed Shengfuzi. In addition， Paotianxiong could not induce PVC in rats， which indicated that Paotianxiong was nontoxic and safe.This method could appropriately reflects the cardiotoxity of Fuzi and its prepared samples. Together with the chemical composition analysis， the contents of diester alkaloids were explored including aconitine， mesaconitine and hypaconitine as well as monoester alkaloids in Fuzi and its prepared products were significantly associated with PVC. Furthermore， there may be some components undetermined facilitating arrhythmia to be worth exploring. This research provides an overall and comprehensive approach to diagnose early clinical cardiotoxity and control the quality of Fuzi， which could not only be a complementary solution for the chemical evaluation， but a new method to ensure its efficacy and security of clinical application.

[Key words]Fuzi； biological assessment； cardiac toxicity； premature ventricular contractions （PVC）； minimal toxic dose； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162017

附子是确有疗效的毒性中药。以参附注射液、四逆汤为代表的附子制剂，对于各种急、慢性心衰均具有显著疗效，奠定了附子在中医临床的特殊地位。然而，近十多年来，东亚地区几乎每年都有附子中毒的不良反应报道；究其原因，多与饮片质量密切相关^[1-2]。通过文献和临床实际调查，发现附子及其炮制品导致的不良反应，除极个别特殊病例发生死亡，绝大部分都是饮片质量波动引起心律失常为主的心脏毒性^[3]。附子的毒性成分主要是乌头碱类物质，具有强烈的心脏毒性。附子炮制后可显著降解剧毒的乌头碱类成分，起到炮制减毒的效果，保障临床应用安全性。文献研究表明，乌头碱中毒后，在哺乳动物心电图上依次表现为室性早搏、室性心动过速、心室纤颤、心室扑动以及停搏^[4-5]，其中室性早搏是乌头碱和附子心脏毒性最早期的中毒标志。然而，目前尚缺乏针对这一早期心脏中毒反应的评价方法。因此，测定附子引起大鼠室性早搏的最小中毒量（MTD），可作为附子炮制品减毒程度和质量评价的重要参考指标。本文探索建立基于室性早搏MTD测定的附子炮制品质量生物评价方法，通过对测定方法学的研究，明确了相关的影响因素；以此为基础，评价了生附片、黑顺片、白附片、蒸附片、炮天雄、刨附片的生物毒性，为附子的质量评价与临床应用提供了新的思路与方法。

1 材料

1.1 药物

黑顺片、炮天雄、蒸附片、刨附片、白附片于2014年10月采购于四川江油中坝附子科技有限公司。经中国人民解放军第三〇二医院肖小河研究员鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工炮制品。

1.2 试剂

乌头碱对照品购于成都克洛玛生物科技有限公司，批号150322；二氯甲烷，乙酸乙酯，异丙醇，乙酸铵，浓氨，乙醇均为分析纯，购于北京化工厂；去离子水（自制）；乙腈（色谱纯，Fisher）；氯化钠注射液购于石家庄四药有限公司，批号15111103201；乌来糖（氨基甲酸乙酯）购于国药集团化学试剂有限公司，批号No20060227。

1.3 仪器

RM6240BD型多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）；BYZ-810T注射泵（长沙比扬医疗器械有限公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器及UV检测器）；Gradient A10 Mill-Q 超纯水器（法国 Millipore 公司）；Sartorius-BS110S千分之一分析天平、1/10万分析天平（德国赛多利斯公司）；台式冻干机（北京博医康实验仪器有限公司）；超声波清洗仪（上海声彦超声波仪器有限公司）。

1.4 动物

SD大鼠，SPF级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK-（军）2007-004。

2 方法与结果

2.1 测定方法与评价指标

2.1.1 心电图的测定 大鼠用20%乌来糖溶液（8 mL·kg^-1）麻醉，背位固定，连接电极用多道生理信号采集处理系统测定二导联心电图，描记正常心电图。注射器与头皮针相连，一端固定于微量注射泵上，另一端接于大鼠尾静脉中，以2 mL·h^-1恒速推注乌头碱溶液或附子炮制品提取液，观察并记录心电图的变化，直至出现心室早搏（PVC）的变化，即首次出现QRS波倒置及变宽，记录此时的推注体积。体积越小，样品毒性越强。大鼠正常心电图与室性早搏的心电图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备^[6] 精密称取乌头碱对照品适量于棕色量瓶中，加无水乙醇超声并定容，配制质量浓度为200 mg·L-1 的对照品母液。取0.5 mL于20 mL离心管量瓶中，加生理盐水稀释、定容，即得质量浓度为5 mg·L^-1的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取附子供试品粉末约2 g，加入70%乙醇20 mL，超声提取30 min（功率300 W，频率40 kHz，水温在25 ℃以下），离心（5 000 r·min^-1，10 min）分离上清液，加入70%乙醇定容至20 mL。将提取液转移至蒸发皿中，置于通风橱中，待溶剂挥发至约1 mL，转移并用生理盐水定容至2 mL，生附子用生理盐水定容到5 mL，即得供试品溶液。

2.1.4 MTD计算方法 对于对照品而言，出现室性早搏的MTD为推注乌头碱的质量除以大鼠的体重；对于附子饮片而言，出现室性早搏的MTD为推注饮片的质量除以大鼠的体重。

2.1.5 统计方法 采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计分析，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；方差齐采用LSD分析，方差不齐采用Tamhane分析。

2.2 基于室性早搏中毒量测定的方法学研究^[7]

2.2.1 动物性别的选择 取体重为（200±20）g的SD雌雄大鼠各6只，实验前准确称重。以5 mg·L^-1的对照品溶液为测试液，按2.1项下方法测定乌头碱的最小中毒量，研究动物性别对毒性的影响，结果见图2。由图可知，雄性动物的MTD为10.25±1.43，组内RSD为13.95%；雌性动物的MTD为12.26±2.14，组内RSD为17.48%；尽管经统计分析，两者结果无显著性差异，但从RSD可看出，雄性动物的数据更集中，组内差异更小，有利于提高结果分析的准确度，故确定雄性大鼠为实验动物。

2.2.2 动物体重的选择 取体重分别在（200±20），（240±20），（280±20） g的SD雄性大鼠各6 只，实验前准确称重。以5 mg·L^-1的对照品溶液为测试液，按2.1项下方法测定乌头碱的最小中毒量，研究动物体重对毒性的影响，结果见图3。由图可知，（200±20） g动物的MTD为10.25±1.43，组内RSD为13.95%；（240±20）g动物的MTD为11.77±3.65，组内RSD为31.01%；（280±20）g动物的MTD为10.11±2.65，组内RSD为26.23%，尽管经统计分析，三者结果无显著性差异，但从RSD可看出，体重在（200±20）g动物的数据更集中，组内差异更小，有利于提高结果分析的准确度，故确定体重在（200±20）g大鼠为实验动物。

2.2.3 对照品储备液稳定性的考察 取体重在（200±20）g的SD雄性大鼠，分别在对照品溶液存放第0，3，7 天测定其最小中毒量，每组各6 只，实验前准确称重。以5 mg·L^-1的对照品溶液为测试液，按2.1项下方法测定乌头碱的最小中毒量，研究对照品储存时间对毒性的影响，结果见图4。由图可知，当天配制的对照品MTD为10.25±1.43，组内RSD为13.95%；储备3 d的对照品MTD为13.87±2.46，组内RSD为17.75%；储备7 d的对照品MTD为12.97±3.99，组内RSD为30.80%。经统计分析，储备3，7 d的标准液与当天配制的标准液有显著性差异，说明标准液储备时间越长其毒性降低。从RSD可看出，当天配制的对照品的数据更集中，组内差异更小，有利于提高结果分析的准确度，因此对照品临用现配。

2.2.4 供试品储备液稳定性的考察 取体重在（200±20）g的SD雄性大鼠，分别供试品溶液存放第0，3，7天测定其最小中毒量，每组各6 只，研究供试品储存时间对毒性的影响，结果见图5。当天配制的供试品MTD为2.27±0.54，组内RSD为23.63%；储备3 d的供试品MTD为3.88±1.11，组内RSD为28.81%；对照品储备7 d的MTD为4.58±1.54，组内RSD为33.59%。经统计分析，储备3，7 d的供试品与当天配制的供试品有显著性差异，说明供试品储备时间越长其毒性降低。从RSD可看出，当天配制的供试品的数据更集中，组内差异更小，有利于提高结果分析的准确度，因此供试品需临用现配。

2.2.5 方法重现性 准确称取同一黑顺片样品细粉6 份，按标准化后的方法测定它们的MTD。分别为2.36，1.92，2.28，3.18，2.29，1.58 g·kg^-1，其RSD为23.63%，符合药品质量生物评价方法的技术要求^[8]。

2.3 不同附子的炮制品毒性测定

运用此方法测定生附子、黑顺片、蒸附片、刨附片、白附片、炮天雄的MTD，结果见图6。生附子的毒性显著高于其他炮制品（P<0.05），其中黑顺片、蒸附片、刨附片与白附片的MTD分别是生附子的15.76，22.36，19.65，20.97倍，不同炮制的附子最小中毒剂量各不相同，但毒性存在一定差异。炮天雄检测不出MTD，安全无毒。整体而言，除生附子外，其余饮片的毒性强弱顺序为黑顺片>白附片>刨附片≈蒸附片>炮天雄。

3 化学评价的方法与结果

3.1 不同附子的炮制品化学成分的HPLC测定^[9-10]

对照品溶液的制备：精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱及次乌头碱适量，加入0.05%盐酸-甲醇溶液溶解，定容，制得质量浓度分别为40.4，43.6，43.2，101.6，49.2，100.0 mg·L^-1的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取附子不同炮制品，样品粉碎，过3号筛。取粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，水温在25 ℃以下）30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 mL，通风橱中回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

色谱条件：Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A相为乙腈-0.04mol·L^-1醋酸铵溶液（浓氨溶液调pH 10.0）（1∶3），B相为乙腈-0.04 mol·L^-1醋酸铵溶液（浓氨溶液调pH 10.0）（65∶35），梯度洗脱，0～20 min，10%～22% B；20～30 min，22%～37% B；30～40 min，37%～47.5% B；40～45 min， 47.5%～52% B；45～65 min， 52%～60% B；65～75 min，60%～75% B；75～80 min，75%～95% B；流速0.8 mL·min^-1；检测波长235 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

附子酯型生物碱含量测定结果见表1。生附子的双酯型生物碱含量远高于其他饮片，炮制后各饮片中双酯型生物碱含量大幅降低，而部分饮片如黑顺片、蒸附片等单酯型生物碱含量升高。从双酯型生物碱含量来看，白附片略高于黑顺片；但根据MTD生物测定结果来看，白附片的PVC心毒性低于黑顺片；说明仅仅依据《中国药典》标准衡量附子饮片的毒性还有一定的局限性，有必要对毒性成分含量与MTD的相关性进行进一步分析。

3.2 化学含量与MTD相关性分析

依据图6测定的MTD数据与表1测得的生物碱含量数据，采用线性相关分析研究各成分与MTD的相关性。相关系数计算结果以热图形式表示，采用Hem I软件作图，见图7。由结果可知，双酯型生物碱含量与MTD呈明显的负相关，单酯型生物碱对MTD的影响规律为苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱，而苯甲酰次乌头原碱对MTD的影响微乎其微，这与上述单体成分的毒性强弱结果是基本一致的^[11]。上述研究提示，附子炮制品致心律失常毒性主要与双酯型生物碱有关，同时，苯甲酰乌头原碱的作用也不可忽略。由前期研究可知，生附子中主要是双酯型生物碱，单酯型生物碱含量很低，加热炮制水解后，双酯型生物碱大量水解为单酯型生物碱，饮片中单酯型生物碱丰度很高，而双酯型生物碱丰度很低。尽管单酯型生物碱的毒性远弱于双酯型生物碱，但在饮片中，大量的单酯型生物碱仍对饮片的整体毒性有一定影响。这也说明，单纯采用《中国药典》的双酯型生物碱含量之和，并不能完全代表饮片的整体毒性，而本文提供的基于大鼠室性早搏心脏毒性的附子质量生物评价方法可作为有益补充。

4 讨论

评价标准的科学性对于确保饮片质量至关重要。目前，关于附子毒性评价，主要分为化学评价与生物评价2种方法。化学评价以2015年版《中国药典》为代表，规定黑顺片、白附片中3种双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的总和不超过0.02%。但该方法存在一定问题：其一，3种成分不能完全代表附子的整体毒性，还存在其他的剧毒成分，如印乌头碱、3-乙酰乌头碱等；其二，3种成分的毒性并不相同，次乌头碱的毒性仅为乌头碱的1/3，三者之和简单相加缺乏依据^[12]。生物评价以急性毒性的改良寇氏法为代表，通过测定灌胃后动物的半数致死量LD₅₀或最大耐受量作为评价依据。但该法实验周期长，消耗动物量大，灵敏度也较低，很难满足生物测定的要求^[13]。为了克服上述不足，课题组前期建立了通过大鼠尾静脉推注附子提取液，测定最小致死量的生物毒价评价方法^[7]，并进一步建立了基于毒性系数校正的含量测定方法——附子毒性成分指数^[14]，用于生附子的毒性评价。尽管这些方法快速准确，但主要适用于泥附子或生附子的整体毒性评价，而炮制品由于毒性较低，很多样品难以直接测出最小致死量^[15]，需要建立新的检测更加灵敏的方法。

附子中乌头碱类成分多而复杂，其毒性强弱不能一一去表征，需在整体动物上评价附子毒性强弱。通过文献和临床实际调查，除极个别特殊病例发生死亡，绝大部分都是饮片质量波动以引起心律失常为主的心脏毒性。本方法在附子饮片的微毒评价中具有准确性、快速性、经济性等技术优势。首先，通过测定动物出现室性早搏的最小中毒量，能准确直观地表征附子饮片的毒性；其次，本方法在测定过程中，大鼠一般5 min左右即出现室性早搏；而一般的HPLC，单样本的测定时间在60～90 min^[10]；而传统的改良寇氏法则需2周的观察周期^[16]；本方法具有更快的检测速度，有利于多样本的快检。第三，由于本方法在测定过程中仅需测定最小中毒量，动物处于轻度中毒状态，并不死亡。而乌头碱等成分在体内的代谢速度较快^[17]，待麻醉剂乌来糖及附子成分代谢完毕后，动物仍可重复使用，大大降低了实验动物的消耗，节约了检测成本，也更加符合实验动物的伦理与福利要求。此外，本方法技术难度小，无需特殊实验设备，有利于该方法的推广应用。

本方法的建立为附子、也可适用于川乌、草乌的早期心脏毒性评价提供了新的方法。①可用于附子配方颗粒的质量评价；在中药配方颗粒全面放开的条件下，如何确保免煎附子（黑顺片、淡附片）配方颗粒冲服时的安全性，中药质量易受多种因素影响^[18]。如何快速识别评价产品质量（毒性）的一致性，更显紧迫性与必要性。②可用于不同商品等级黑顺片的质量评价；传统商品规格讲求辨状论质，黑顺片以片张大、乌黑油亮为佳，但市场流通的黑顺片大小、颜色差异明显，不同等级黑顺片毒性是否明显不同，值得探究。③可用于含附子注射剂的质量评价；注射剂静脉给药，较之于口服给药，安全风险相对较高，运用本方法在质检环节严格把关，将有助于控制药物风险，避免因原料质量或工艺因素波动造成的中毒反应。

综上所述，本文提出的基于室性早搏中毒量测定的附子早期心脏毒性评价方法是一种关联临床、直观准确、快速经济的生物毒性评价方法，有利于确保临床用药的安全可靠，为附子饮片或制剂的质量评控提供了新的研究思路与参考实例。

[参考文献]

[1]Chan T Y. Incidence and causes of Aconitum alkaloid poisoning in Hong Kong from 1989 to 2010[J]. Phytother Res， 2015， 29（8）：1107.

[2]Chan T Y. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots[J]. Phytother Res， 2016， 30（1）：3.

[3]Chong Y K， Ching C K， Ng S W， et al. Recipes and general herbal formulae in books：causes of herbal poisoning[J].Hong Kong Med J， 2014，20（4）：343.

[4]张硕峰， 吴金英， 贾占红， 等. 附子中乌头碱对大鼠心功能效-毒剂量关系测定[J]. 中国实验方剂学杂志， 2012， 18（19）：222.

[5]王懿， 孙蓉. 基于“回阳救逆”功效附子对小鼠心电图影响的“效-毒”关联评价[J]. 世界中医药， 2014（2）：155.

[6]张定堃， 王伽伯， 杨明， 等. 中药品质整合评控实践：附子品质综合指数[J]. 中国中药杂志， 2015，40（13）：2582.

[7]Qin Y， Wang J B， Zhao Y L，et al. Establishment of a bioassay for the toxicity evaluation and quality control of Aconitum herbs[J]. J Hazard Mater， 2012， 199/200：350.

[8]周海均. 生物技术药物的最新进展[J]. 中国医药指南，2003（7）：46.

[9]张定堃， 韩雪， 周永峰， 等. 附子精标饮片的研制（Ⅰ）：规格大小与质量均一性研究[J]. 中国中药杂志， 2015， 40（17）：3488.

[10]陈东安， 易进海， 黄志芳， 等. 附片指纹图谱研究及6种酯型生物碱含量测定[J]. 中国中药杂志， 2010， 35（21）：2829.

[11]张定堃， 韩雪， 李瑞煜， 等. UPLC-Q-TOF-MS分析不同产地泥附子化学成分的差异[J]. 中国中药杂志， 2016，41（3）：463.

[12]张定堃， 杨明， 韩雪， 等. 中药炮制工艺研究新策略：个性化炮制与过程控制论[J]. 中国中药杂志， 2015， 40（16）：3323.

[13]周子渝，熊永爱， 黄勤挽， 等. 附子不同炮制品及其部位急性毒性研究[J]. 成都中医药大学学报， 2012， 35（3）：63.

[14]Zhang D， Li R， Han X， et al. Toxic constituents index （TCI）：a toxicity-calibrated quantitative evaluation approach for the precise toxicity prediction of the hypertoxic phytomedicine-aconite[J].Front Pharmacol， 2016， 7：164.

[15]温瑞卿， 李东辉， 赵昕， 等. 基于化学分析的毒性中药附子炮制方法的合理性研究[J]. 药学学报， 2013， 48（2）：286.

[16]谢晓芳， 彭成， 易进海， 等. 附子不同炮制品提取物急性毒性的比较研究[J]. 中药与临床， 2012， 3（3）：29.

[17]何雷萍， 狄斌， 杜迎翔， 等. 4种附子配伍方给药后大鼠血浆中3个乌头类生物碱的药动学比较[J]. 中国药科大学学报， 2010，41（1）：55.

[18]王伽伯，金城，李会芳，等.泻下类中药质量的生物控制方法及基本问题探讨[J]. 药学学报，2009（5）：500.

[责任编辑 马超一]