文/山东绿都生物科技有限公司 张文通 沈志强

山东省滨州畜牧兽医研究院 魏 凤 李 峰 王金良 苗立中 刘吉山 沈志强

一例猪伪狂犬变异株的诊治

文/山东绿都生物科技有限公司 张文通 沈志强

山东省滨州畜牧兽医研究院 魏 凤 李 峰 王金良 苗立中 刘吉山 沈志强

为对山东省某养猪场疑似猪伪狂犬病进行诊断，采用发病情况调查、临床症状、病理剖检、病原分离、PCR鉴定及血清中和试验诊断，确诊病原为猪伪狂犬病毒变异株。根据确诊结果，按照猪伪狂犬病治疗措施操作，猪场发病情况得到有效控制。

猪伪狂犬变异株；诊治；病原分离

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的一种猪急性传染病，以发热、奇痒及神经系统障碍为特征。成猪一般呈隐性感染；妊娠母猪发生流产、死胎；新生仔猪除出现发热和神经症状外，还可见呕吐、腹泻。该病几乎遍布世界各地，我国绝大部分地区均有流行［1～4］。2015年12月，山东某养猪场出现以妊娠母猪流产、产死胎，存活仔猪（10日龄左右）出现大量死亡为特征的疑似猪伪狂犬病。现将诊断过程介绍如下。

1 发病情况调查

2015年12月初，山东某养猪场出现妊娠母猪流产、产死胎，流产及产死胎率达30%；10日龄左右仔猪出现抽搐、腹泻等症状，发病率高达100%，死亡率33%。按仔猪大肠杆菌病用抗生素治疗，无效。

2 临床症状

妊娠母猪流产、产死胎。患病仔猪体温为41℃左右、腹泻、临死前抽搐。

3 病理变化

剖检病死仔猪：脑出血或充血，肝、脾有白色坏死点，肺水肿，淋巴结出血等病变。

4 实验室诊断

4.1 病料采集与处理

取病死仔猪脑组织作为病料。将采集的病料剪碎、添加3倍灭菌生理盐水，用匀浆器研磨制成悬液；悬液反复冻融3次；低速离心取上清，-80℃冰箱冻存备用。

4.2 病毒分离培养

将4.1冻存的上清，用0.22μm滤膜过滤除菌，作为细胞接种病料；待Vero细胞长满单层后，弃掉细胞培养液，按照5%比例将处理好的病料接种Vero细胞，37℃吸附1h后，换为含2% FBS的DMEM细胞维持液，置于37℃恒温培养箱中继续培养，每天观察细胞病变（CPE），并记录。待85%细胞出现细胞病变时，将其收获冻存，备用。如果无CPE出现，连续盲传6代，同时设正常细胞对照。

图1 病毒接种细胞（左图接种病料，右图细胞对照）

图2 PRV gE的PCR结果

4.3 病毒RT-PCR鉴定

4.3.1 引 物 设 计 根 据GenBank KP722022的DNA序列，利用Prime 5.0软件，设计扩增长度约805bp的PRV gE基因。引物合成单位为生工生物工程（上海）股份有限公司。扩增PRV gE的引物序列为：上游引物：5'-CCATGCGGCCCTTTCTGCTG-3'；下游引物：5'- TAGTACCAGTCCAGCGT GGC-3′。

4.3.2 病毒DNA基因组提取 蛋白酶K法提取病毒DNA。详细操作方法如下：取上述4.1中-80℃冻存的上清535μL、加入10% SDS溶液60μL、再加入蛋白酶K（20mg/mL）5μL，55℃水浴1h；等体积（600μL）的酚∶氯仿（1∶1）混合物抽提，12，000rpm离心5min；取上清加入等体积的氯仿∶异丙醇（24∶1）抽提，12，000rpm离心5min；取上清加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠（3mol/L），混匀，-20℃沉淀30min；12，000rpm离心10min，弃上清，沉淀，室温晾干，加入30μL的灭菌蒸馏水溶解。溶解液即为病料的DNA基因组。

4.3.3 病 毒 的PCR PCR体 系：2.5μL 10×PCR Buffer、2.0μL dNTP（10mmol/L）、0.5μL P1、0.5μL P2、0.5μL rTaq、4μL DNA、15μL灭菌水。

PCR反应程序：94℃ 5min、94℃ 1min、60℃ 70s、72℃ 1min、35个循环后、72℃延伸10min。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物用琼脂糖凝胶（浓度为1%）电泳检测。电泳结果与设计扩增大小片段相符（设计片段大小为805bp）。结果见图2。

用多功能DNA纯化回收试剂盒（BioTeKe）回收PCR产物，连接到pMD18-T载体。送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果如图3。

将该测序产物翻译成氨基酸序列，其中48位有1个天冬氨酸插入，这与赵鸿远等［4］报道猪伪狂犬变异株gE基因分子特征一致。

4.4 病毒血清中和试验

已知Bartha K61中和抗体效价为1∶32血清及Bartha K61毒株为山东绿都生物科技有限公司保存。按照2010年版《中国兽药典》附录49方法，用分离的毒株测上述已知血清抗体效价。同时用Bartha K61毒株作对照。

图3 PRV gE的核苷酸序列

试验结果显示：Bartha K61毒株能够正确测出上述已知中和抗体效价的血清，而新分离毒株仍有病变、不能被上述血清中和。因此，相对Bartha K61毒株，新分离的猪伪狂犬毒株在抗原性上发生了变异。

5 治疗

①深埋病死猪，隔离发病猪。用碘制剂消毒剂对全场特别是发病猪舍及四周严格消毒，1次/d，连续消毒1周。严格生物安全措施，禁止发病猪舍与健康猪舍之间的人流与物流混杂。

②全场所有猪群紧急接种武汉科前生物的科卫宁（HB-98株活疫苗）+科威宁（鄂A株灭活疫苗）。其中先免科威宁（鄂A株灭活疫苗），3周再加强1次；间隔1个月之后免科卫宁（HB-98株活疫苗）。免疫方法按照疫苗说明书操作。

③对所有发病猪群饲料添加广谱抗生素及电解多维，连用7d。控制继发感染。

通过采取上述措施，2个月后回访该猪场，猪场发病情况已转危为安。■

［1］ 单虎，李明义，沈志强.现代兽医兽药大全［M］.北京：中国农业大学出版社，2011：304～307.

［2］ 彭金美，安同庆，赵鸿远，等.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析［J］.中国预防兽医学报，2013，35（1）：1～4.

［3］ 张青占.变异猪伪狂犬病毒的分离鉴定及生物学特性分析［D］.北京：中国农业科学院，2013.

［4］ 赵鸿远.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其生物学特性的研究［D］.北京：中国农业科学院，2014.

山东省农业科学院院地科技合作引导计划项目 214YDHZ32；山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目SDAIT-06-022-15。