赵敏，徐宸，贾凌，程廷才，汪长国，戴亚，夏庆友

1 重庆烟草科学研究所，重庆市北碚区天生路2号 400715;

2 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆市北碚区天生路2号 400715;

3 重庆中烟工业有限责任公司技术中心，重庆市南岸区南坪东路2号 400060

烟草叶面细菌区系检测探针的设计及优化

赵敏1，徐宸1，贾凌2，程廷才2，汪长国3，戴亚3，夏庆友2

1 重庆烟草科学研究所，重庆市北碚区天生路2号 400715;

2 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆市北碚区天生路2号 400715;

3 重庆中烟工业有限责任公司技术中心，重庆市南岸区南坪东路2号 400060

为快速准确地检测烟草叶面的细菌种群，本研究利用基因芯片技术，采集我国主要烟区主栽品种旺长期叶面微生物进行宏基因组测序，结合生物信息学分析方法，筛选用以检测其中细菌种属特异性的探针。宏基因组数据分析表明，烟草叶面的宏基因组整体质量值较高，Q20、Q30分别占总碱基数99.2%、81.4%，测序长度为100 bp，碱基分布均匀，所获得测序数据可用于后续探针设计。Blast比对结果表明共筛选出候选探针200条，属于9种细菌属，其中属于假单胞菌属的探针有165条。该结果为基因芯片技术应用于烟草叶面的细菌种群的检测提供了坚实的基础。

烟草；叶面；探针；细菌种属

植物叶面作为一个独立的微环境域，通常栖息着细菌、酵母菌、真菌等微生物，形成了微生物种群之间、正常的微生物与宿主之间的微生态体系。微生物的活动是影响植物生长发育的关键因素。其中，细菌是叶面环境中最主要的微生物类群[1]。已有文献报道，植物叶面细菌的充分利用有助于促进植物生长、减少化肥和农药投入，实现农业的可持续发展[2-4]。例如：冬小麦叶际分离的菌株D5/23T能产生植物生长激素，固定大气中的氮气，促进植物生长，增加作物的产量[5-6]；从拟南芥、大麦、玉米、大豆叶面分离的粉色色素兼性甲基营养菌、小黑麦叶际的假单胞菌和豌豆叶际分离的分枝杆菌等也能促进植物的生长[7-9]；解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌这2种常见叶际细菌，能分别被用来防治油菜菌核病和保护植物免受昆虫的侵食[10]。

烟草作为经济作物，叶面细菌对烟叶品质、抗性等有着重要的作用[11-12]。早在19世纪50年代中叶，人们就开始探索微生物在烟草品质形成中的作用。陈福星等从烤烟烟叶上分离鉴定的 4 个优势菌种，用其处理的烟叶优于人工或自然发酵，其不仅有效缩短发酵时间，且烟叶品质及色香味均有一定程度的提高[11]。韩锦峰等比较了未发酵、自然陈化及人工发酵期间烤烟叶面微生物的变化，并筛选优势菌种混合配制成生物制剂用于烟叶发酵，结果表明，混合菌制剂可加速烤烟发酵，提高烟叶品质，并具有抑制烟叶霉变的作用[12]。到目前为止，绝大多数研究都是关于烟草陈化过程中烟草叶面微生物，而关于其在大田期的研究较少。对大田期烟草叶面微生物的快速检测有助于有益细菌的更好利用，从而增强烟草叶片的品质、拓展烟草叶面细菌在烟草生长、抗虫以及抗病方面的应用。然而，前人鉴定微生物均通过菌培养法，费时费力。

基因芯片是一种高通量的核酸检测技术，在科研、临床方面有大量应用[13-16]。本研究采用基因芯片技术构建烟叶表面菌种快速鉴定系统，通过宏基因组测序寻找优势菌及其特异性核酸序列，并将各种待检微生物基因的特异性片断作为核酸探针固定于生物芯片的表面，制备成微生物检测基因芯片。这种芯片可以通过检测确定待检样品中病原微生物的种、属、亚型，并进一步分析其毒性、致病性和抗药性[17-19]。与传统方法相比，该方法具有检测范围广、检测速度快、样品用量少的优点[20]。本实验利用叶面微生物宏基因组数据设计、优化探针，旨在构建微生物芯片以快速准确检测烟草叶面的各种有益有害细菌的种类。

1 材料与方法

1.1 试剂与软件

1.1.1 试剂

OMEGA E.Z.N.A DNA试 剂 盒，TruSeq DNA Sample Preparation Kits v2 Box A、TruSeq DNA Sample Preparation Kits v2 Box B、Mate Pair Library Prep Kit v2、TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit、Truseq PE Cluster Kit V3-cBot-HS、TruSeq SBS Kit v3-HS 购自美国Illumina公司，FailSafe™ PCR Enzyme Mix购 自 美 国Epicentre公 司，NEBNext End Repair Module、NEBNext dA-Tailing Module、NEBNext Quick Ligation Module购自美国NEB公司，2100 chip 1000 kit for DNA购自美国Agilent公司，AMPure XP beads购自美国Beckmam coulter有限公司，PicoGreen dsDNA Assay Kit购自美国Invitrogen公 司，QIAGEN MinElute PCR Purification Kit、QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit购自美国Qiagen公司，Certified Low Range Ultra Agarose购自美国Bio-Rad公司。

1.1.2 软件

FASTQC 软件 v0.11.4（http∶//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）、SeqPrep软件（https∶//github.com/jstjohn/SeqPrep）、Sickle软 件（https∶//github.com/najoshi/sickle）、自编 perl 程序、bowtie软件v1.1.2、blast v2.2.28 软件。如无特殊说明，软件多采用默认参数运行。

1.2 方法

1.2.1 宏基因组原始数据质量评估

采集福建三明的翠碧一号（W1）、广东南雄的粤烟97（W2）、云南大理的红花大金元（W3）、河南平顶山的中烟100（W4）的旺长期发育正常的中部烟叶（9～11叶位）。将不同时间采集的烟叶分批次处理。首先将烟叶放置于无菌离心管，用无菌水冲洗数次后过滤（0.22 μm）。将滤膜剪碎后提取基因组并采用超声法Covaris制备DNA样品。首先将大片段DNA随机打断，然后将粘性末端修复成平末端，再通过3’ 端加碱基“A”，使得DNA片段能与3 ’端带有“T”碱基的特殊接头连接。随后电泳回收目的片段连接产物，最后使用PCR扩增并纯化两端带有接头的DNA片段。利用Agilent 7500芯片检测文库质量后上机。

将原始图像数据经过 Base Calling 转化为序列数据（FASTQ 格式）。FASTQ 格式文件记录所测读段（read）的碱基及其质量分数。Read 的质量分数以不同的字符来表示，其中每个字符对应的 ASCII 值减去33，即为对应的测序质量值。碱基质量从 0～40，即对应的 ASCII 码为从 “！”（0+33）到“I”（40+33）。将测序错误率用 E 表示，Illunima HiSeq 2000/ Miseq的碱基质量值用 Q 表示，则有下列关系：

公式 1：Q = -10log10(E)

其中E为该碱基被测错的概率，测错的概率越小，碱基质量值Q越高，通常认为Q20为高质量碱基。利用 FASTQC 软件，对原始 reads 质量值进行评估，并对原始reads长度和碱基分布进行了统计。

1.2.2 原始数据预处理

使用 SeqPrep（https∶//github.com/jstjohn/SeqPrep）和 Sickle（https∶//github.com/najoshi/sickle）软件对原始数据进行预处理，具体条件如下：

（1）由于探针设计长度为70 mer ，因此，将序列末端（3’端）质量较低（质量值小于20）的碱基修剪掉；（2）去除含 N 比率超过 5 个的 reads；（3）去除平均质量值小于 20 的 reads；（4）去除连续低质量碱基个数≥8 个，或者低质量碱基个数≥15个的reads；（5）去除某种碱基含量≥80%的 reads，如 polyA 序列。

1.2.3 候选探针的统计及比对

利用自编 perl 程序，统计有效 reads 中，70 mer长度序列种类及在高质量测序reads 中出现的次数。从中筛选出现次数≥10 次的70 mer序列，作为候选探针。利用自编perl 程序计算候选探针的GC及理论Tm值。理论Tm值计算公式见公式2。

公式 2：Tm = 81.5 + 16.6×Log10[Na+] + 0.41×(%GC)-600/L

筛选理论Tm值在68～76区间的，且在测序序列中出现超过10次以上的探针，使用 bowtie软件，将其与NCBI GenBank数据库中所有细菌全基因组序列进行比对。过滤掉不能与细菌基因组比上的探针，剩余能够与细菌基因组比对上的探针，筛选出保守性好的探针作为候选检测探针。

对筛选的探针进行细菌种类筛选及宿主非特异性杂交检验。保守性较好的探针，使用 blast软件将其与nt 数据库进行比对，对探针进行特异性检验。利用自编 perl 程序，筛选在属和种层面与其他物种无非特异性杂交的探针，作为最终探针的候选。随后使用blast 软件，将候选探针与烟草（Nicotianatabacum,NCBI taxonomy ID∶ 4097）基因组进行比对，过滤掉能够在烟草基因组上比对上的探针。

2 结果与分析

2.1 原始read质量、长度及碱基分布统计

将宏基因组测序得到的原始图像转化为FASTQ格式，利用FASTQ软件，对原始reads质量进行了评估，评估结果如图1。从图中可看出，测序的整体质量值比较高，Q20占总碱基数99.2%，Q30占总碱基数81.4%，所获得测序数据达到后续分析要求。对reads的长度分析发现，测序reads长度绝大多数在100bp（图2）。而碱基所占百分比会因物种的差异而不同，从图3可知，该文库碱基分布均匀稳定，GC含量占54.2%，在正常范围内。

图1 测序原始 reads 各位置质量值分布图Fig. 1 Evaluation of the quality of each position based on the original reads

图2 测序原始 reads 长度分布Fig. 2 Length distribution of the original reads

图3 测序原始 reads 碱基分布Fig. 3 Base distribution of the original reads

2.2 原始数据预分析结果

为消除Illumina Hiseq2000原始测序数据中可能存在的测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，利用SeqPrep和Sickle软件对原始测序数据进行过滤，结果如表1。从中筛选出现次数≥10 次的 70 mer 序列，作为探针候选。利用自编程序计算候选探针的GC及理论Tm值。筛选理论Tm值在68～76区间，且在测序序列中出现超过10次以上的探针，共计56,178条。

表1 原始reads过滤统计结果Tab. 1 Statistical results of the original reads filter

将过滤得到的候选探针与GenBank数据库中所有细菌基因组进行比对。过滤掉不能与细菌基因组比对上的探针，共计44,995 条，剩余能够与细菌基因组比对上的探针 11,183 条，其中，比对到同一种属的基因组上的次数≥10 次的探针有 5,910 条，作为检测探针候选（表2）。

表2 70 mer与细菌基因组比对统计Tab. 2 Comparison of 70 mer and bacterial genome

将保守性较好的5910条探针比对nt数据库，检测该探针的特异性。当整体比对 mismatch 碱基个数≥10 时，或者 3’端 mismatch≥5 时，作为探针不能与该条序列杂交。过滤掉满足上述条件的冗余探针后，剩余候选探针 200 条，可检测 9 个属，分别是鲍特氏菌（Bordetella）1条、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）1条、肠杆菌属（Enterobacter）1条、欧文氏菌（Erwinia）5条、盐单胞菌属（Halomonas）1条、成团泛菌（Pantoea）23条、假单胞菌（Pseudomonas）165条、罗尔斯通氏菌（Ralstonia）1条、耶尔森氏菌（Yersinia）2条，其中检测假单胞菌的探针占绝对优势（见表3，因版面原因不在纸质版刊登，详见电子版）。

为排除候选探针与宿主的非特异性杂交，将过滤后得到的200条候选探针，与烟草基因组比对，发现在所设定的非特异性杂交检测阈值下（当整体比对mismatch碱基个数≥10时，或者3’端 mismatch≥5时），200条探针在烟草基因组上均无非特异性杂交比对。证实这200 条探针可用于检测烟草叶面细菌meta-genome 的种属检测探针（表3）。

3 小结

植物中存在各种微生物，包括有益微生物和有害微生物，这些微生物与植物发生互生、共生、寄生等关系，对植物的生长发育产生多方面的影响。为了鉴定植物中的未知微生物或评价植物微生物效用，研究者曾使用核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、限制性片段长度多态性 (RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、荧光原位杂交技术(FISH)、变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)等传统技术[21]。近年来，随着分子生物学技术平台的不断完善，基因芯片技术以高通量、快速、低成本等优点逐渐成为主流，在植物微生物检测和鉴定方面具有巨大的应用潜力。通过基因芯片技术对植物致病病毒和真菌的鉴定，有利于农业病害的防治，减少经济损失[22-25]。

烟草作为我国重要的经济作物之一，对地方经济的发展具有十分重要的作用。在烟草生长过程中，环境中的微生物与烟草形成了植物-微生物共生体系统[26]。为了快速、全面的检测烟草中的优势或致病微生物种群，本研究首次利用芯片技术，拟建立烟草叶面细菌的检测方法，利用宏基因组测序数据，筛选用以检测烟叶叶面细菌种属特异性的探针。通过对原始数据的质量评估、过滤、候选探针与细菌基因组比对以及候选探针宿主非特异性检测后，最终获得200条可用于检测烟草叶面9个细菌种群的探针。利用含有特异探针的芯片，针对基因芯片技术，采集自我国主要烟区主栽品种旺长期叶面微生物进行宏基因组测序，结果显示，假单胞菌的探针占绝对优势。已有研究表明，假单胞菌广泛存在于植物中，包括绿针假单胞菌（Pseudomonaschlororaphis）[27]、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）[28]、蒙氏假单胞菌（Pseudomonasmonteilii）[29]，能够抑制植物病原微生物的生长，对改善植物营养、促进植物生长具有很好的作用[30-31]。此外，利用该芯片，还鉴定得到部分致病细菌菌群，如青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）[32]、软腐病原菌（Dickeyadadantii）[33]、菠萝泛菌（Pantoeaananatis）[34]、解淀粉欧文氏菌（Erwiniaamylovora）[35]等。这些致病细菌能严重影响烟叶的品质和产量。利用本研究的基因芯片系统，快速准确的鉴定烟草叶面中的细菌种群，为有针对性地利用有益细菌和控制不利细菌以提高烟叶的品质、产量、减少病虫害奠定了基础，为获得优质原料提供了帮助。

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表3 200条探针的结果统计表Tab.3 Results of 200candidate probes

续表3

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续表3

Design and optimization of microbial probes for determination of tobacco foliicolous bacteria

ZHAO Min1, XU Chen1, JIA Ling2, CHENG Tingcai2, WANG Changguo3, DAI Ya3, XIA Qingyou2
1 Chongqing Tobacco Science Research Institute, Chongqing 400715, China;
2 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China;
3 Technology Center, China Tobacco Chongqing Industrial Corporation, Chongqing 400060, China

To rapidly and accurately detect bacterial population on tobacco leaves, gene chip was used for screening bacterial species specific probes from metagenomic sequencing data of varieties grown in main tobacco grown areas. Results showed that the overall quality of sequencing reads was relatively high, with percentage of Q20 and Q30 of 99.2% and 81.4%, respectively. The sequencing length was 100 bp and with well-distributed base. 200 specific candidate probes were identified from blast comparison results, which belong to 9 types of bacteria genera, and 165 probes belong to Pseudomonas. The results showed that gene chip technology can be applied to detect bacteria population in tobacco leaves.

tobacco; phyllosphere; probe; bacterial species

赵敏，徐宸，贾凌，等. 烟草叶面细菌区系检测探针的设计及优化[J]. 中国烟草学报，2016,22（5）

重庆中烟工业有限责任公司科技项目（NO. 130580）；重庆市烟草专卖局科技项目(NY20150601070012)

赵敏（1981—），博士，主要从事微生物与烟叶品质等方面的研究，Tel：023-68219807，Email：lszhaomin@126.com

戴亚（1946—），Email：dycy@263.net

2016-03-02

：ZHAO Min, XU Chen, JIA Ling, et al. Design and optimization of microbial probes for determination of tobacco foliicolous bacteria [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(5)