杨艳华，林素静，刘西京，杜 斌

（1.郑州大学药学院，河南 郑州 450001；2.深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055）

长裂苦苣菜萃取物对胰岛素抵抗 HepG2
细胞糖代谢的影响*

杨艳华1，2，林素静2*，刘西京2，杜 斌1

（1.郑州大学药学院，河南 郑州 450001；2.深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055）

使用高浓度胰岛素来诱导HepG2细胞，使之出现葡萄糖代谢的异常，以此建造胰岛素抵抗HepG2/IR细胞模型，利用葡萄糖测定试剂盒检测长裂苦苣菜石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位组葡萄糖消耗量，研究长裂苦苣菜不同萃取部位对胰岛素抵抗HepG2细胞模型糖代谢的影响.结果显示，10-6mol/L浓度的胰岛素诱导处理HepG2细胞24 h是产生胰岛素抵抗的最佳条件；与HepG2/IR模型组相比，各萃取部位均可以改善HepG2/IR细胞的葡萄糖消耗情况，以乙酸乙酯部位效果最佳.结果表明长裂苦苣菜提取物有一定的改善胰岛素抵抗的作用.

长裂苦苣菜；胰岛素抵抗；HepG2细胞；葡萄糖消耗量

糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者中超过90%为Ⅱ型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus， T2DM），其显著的病理生理学特征为胰岛素调节与控制葡萄糖代谢能力的下降，即胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）[1].HepG2 细胞存在于动物肝细胞，其肝胚胎瘤细胞株的表型与肝细胞很相似，HepG2 细胞中的胰岛素受体数目在高剂量的胰岛素条件下呈下降趋势，且下降程度与刺激持续时间及胰岛素剂量呈正相关.因此，以HepG2细胞模型来研究体外胰岛素抵抗机制和降糖活性物质筛选是理想d的选择[2-3].

长裂苦苣菜（ Sonchus brachyotus DC.）又名苦菜、苦曲菜、苦曲曲、苦苣菜、苣荬菜、苦荬菜等，具有清热解毒、凉血止血之功，常用于治疗急性咽炎、急性痢疾、阑尾炎、肠炎、痔疮肿痛等[4-6].研究表明，长裂苦苣菜具有降糖、抗菌、降压和降胆固醇、抗心律失常、抗肿瘤、保肝、抗炎、清除自由基等作用[4-8].本文以人肝癌细胞HepG2建立胰岛素抵抗模型，探究长裂苦苣菜不同萃取部位对胰岛素抵抗 HepG2 细胞糖代谢的影响.

1 材 料

1.1 药品与试剂

长裂苦苣菜（ Sonchus brachyotus DC.）采自兰州郊区； DMEM高糖培养基（Corning公司）；胰酶、四氮甲唑蓝（MTT）、胎牛血清（Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO）、乙醇（分析纯）、盐酸二甲双胍（上海源叶生物科技有限公司，批号：S16O5G1）；精蛋白生物合成人胰岛素注射液（规格400IU/10mL/支，诺和诺德中国制药有限公司，批号：EVG2553）；葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS），D-Hank’s溶液.

1.2 仪器

DZKW-D-2电热恒温水浴锅（郑州南北仪器设备有限公司）；Milli-Q超纯水机（Milipore）；4001 型旋转蒸发仪（德国Heidolph）；HERA cell 240 型CO2 细胞培养箱（Thermo）；DM IRB 型荧光倒置显微镜（德国Leica ）；BHC-ⅡA2系列生物安全柜（苏净安泰空气技术有限公司）； 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SS-325高压灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）；Multiskan MK3 全自动酶标仪（Thermo）；BS224s电子天平（德国赛多利斯）；可调式移液器（Eppendorf）；细胞培养瓶（25cm2）、96孔细胞培养板（美国Corning公司）.

1.3 细胞系及细胞培养

人肝癌细胞株HepG2，由深圳市大规模细胞培养技术和细胞资源库技术平台王妍教授馈赠.将HepG2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，温度设定37℃，培养基放置在5% CO2培养箱中.传代间隔为2～3天1次，取对数生长期细胞进行实验.

2 方 法

2.1 样品制备与溶液配制

2.1.1 样品制备

取长裂苦苣菜全草粉碎，过10目筛(2.0 mm)，称取60g，70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并滤液，减压回收溶剂，所得浸膏加蒸馏水溶解混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，随后减压回收各有机溶剂，并于60℃烘干，即得不同提取部位，得率分别是0.45%、1.12%和3.25%.精密称量，用完全培养液分别配成0.001、0.01、0.1、0.25 mg/mL备用.

2.1.2 配制完全培养液

取胎牛血清和DMEM高糖培养液按照1: 9比例配置完全培养液.

2.2 胰岛素浓度对胰岛素抵抗细胞模型的影响考察

使用完全培养基将对数生长期HepG2细胞进行稀释，设定细胞浓度为1×105个/mL，将其接种在96孔细胞培养板中培养，单孔200 µL，于37 ℃、5% CO2培养箱中.当细胞贴壁达瓶底80%时，弃上清液，以D-Hank’s液清洗2次，加入新鲜调配的含10-6，10-7，10-8，10-9mol/L胰岛素的完全培养液继续培养细胞，每孔200 µL，一组3个复孔，并设正常培养细胞的平行对照组.培养时间24h，取各组的细胞上清液，以葡萄糖氧化酶法依次测定各组的葡萄糖含量，同时观察记录细胞在显微镜下的形态学变化.

2.3 胰岛素抵抗细胞模型时间影响考察

取对数生长期HepG2细胞，同2.2项下方法培养细胞，加入10-6mol/L的胰岛素后，各组于37 ℃、5% CO2条件下培养8、12、24、36和48 h，取各组的细胞上清液，用葡萄糖氧化酶法依次测定每组的葡萄糖含量，同时观察记录细胞在显微镜下的形态学变化.

通过上述试验选取最优的胰岛素作用时间和胰岛素浓度，建立适宜的HepG2 胰岛素抵抗细胞模型.

2.4 不同浓度各萃取物对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗的影响

根据上述考察参数建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型，设置二甲双胍浓度梯度组、胰岛素抵抗模型组、正常对照组和萃取部位石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浓度梯度组，其中空白组不接种细胞，每组设置5个复孔.正常对照组每孔各加完全培养液200µL，胰岛素抵抗模型组加10-6mol/L胰岛素的完全培养液200 µL/孔，其余给药组每孔分别加入不同浓度溶液200 µL，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养.24h后取各组上清培养液，以葡萄糖氧化酶法测定其葡萄糖含量.随后移出上清培养液，每孔加入180 µL完全培养液和20 µL 0.5% MTT，培养4h，将培养液吸弃，每孔加入150 µL DMSO，震摇10 min，于490 nm处用酶标仪测OD值.

2.5 计算

葡萄糖消耗量（mmol/L）=对照组葡萄糖含量-给药组葡萄糖含量.

2.6 统计分析

3 结 果

3.1 不同浓度胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响

实验结果见表1，可见随着胰岛素浓度的增大，葡萄糖消耗率越来越大，但当浓度达到10-6mol/L时，葡萄糖消耗率突然下降，几乎与正常对照组一致，说明在较低浓度范围时，胰岛素对葡萄糖的消耗具有一定的促进作用，当达到一定量时，导致了胰岛素抵抗，细胞对葡萄糖的消耗急剧降低.当胰岛素浓度在10-6mol/L时，胰岛素诱导HepG2细胞胰岛素抵抗程度达到最大.倒置显微镜下观察，正常组HepG2细胞为菱形或梭形的贴壁细胞，与典型的肿瘤细胞形态学特征相似，10-6mol/L浓度模型组细胞边缘变成稍圆形，说明高浓度胰岛素对HepG2的活性有一定的抑制作用.

3.2 胰岛素作用不同时间对 HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响

加入10-6mol/L的胰岛素完全培养液，分别作用8、12、24、36、48h，测得细胞葡萄糖消耗情况见表2.根据结果可知，在最初达到12h时，胰岛素对HepG2的葡萄糖消耗率达到了最大，为41.58%，随着作用时间的延长，葡萄糖消耗率逐渐降低，在24、36、48h分别为20.29%、17.33%、8.98%，说明在24h小时已开始出现胰岛素抵抗，故本实验建立胰岛素抵抗模型中最佳胰岛素浓度为10-6mol/L，最佳作用时间为24h.

3.3 不同萃取部位对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响及MTT检测结果

由结果可知，正常组（p<0.05）单位细胞葡萄糖消耗量明显高于模型组，说明胰岛素抵抗HepG2细胞模型建立成功.另一方面，MTT检测的OD值却显著降低（p<0.05），说明高浓度的胰岛素对细胞产生了一定的毒性，这也可能是导致模型组葡萄糖消耗量下降的原因之一.与HepG2/IR 模型组相比较，二甲双胍不同浓度作用于模型细胞后，模型细胞的葡萄糖消耗量均有不同程度增加，其中葡萄糖消耗量最多的是0.25和0.1 mg/ml浓度组，但由于模型组的OD值（p<0.05）明显高于0.25 mg/ml浓度组的OD值，说明此浓度下二甲双胍的细胞毒性较强，这也可能是二甲双胍在高浓度时对葡萄糖的消耗量反而降低的缘故.

不同浓度石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位作用于模型细胞后，均不同程度地改善了模型细胞的胰岛素消耗量.尤以较高的浓度组0.1、0.25mg/ml对葡萄糖的消耗具有较显著的作用（分别为p < 0.01和 p < 0.05）.

3组随着浓度的增加，OD值也随之增加，表明3个不同萃取部位对HepG2细胞的增殖有一定的促进作用，抵消了胰岛素对细胞的毒性作用，同时三组的对葡萄糖的消耗也随之增加，这也可能是长裂苣荬菜改善胰岛素抵抗的机制之一.从整体葡萄糖消耗量分析可见，模型细胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明显，说明乙酸乙酯部位改善胰岛素抵抗效果最佳.结果见表3.

表1 不同浓度胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响（±S ，n=5）

表1 不同浓度胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响（±S ，n=5）

胰岛素浓度/（mol·L-1）葡萄糖含量/（mmol·L-1）葡萄糖消耗率/（%）0 6.407±0.267 -10-95.770±0.256 9.94 10-85.513±0.286 13.95 10-75.566±0.270 13.12 10-66.589±0.247 -

表2 胰岛素作用不同时间对 HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响（±S，n=5）

表2 胰岛素作用不同时间对 HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响（±S，n=5）

时间/h正常组葡萄糖含量/（mmol·L-1）胰岛素组葡萄糖含量/（mmol·L-1）葡萄糖消耗率/（%）8 3.534±0.0778 2.748±0.0769 22.24 12 2.109±0.386 1.232±0.463 41.58 24 7.224±0.207 5.758±0.214 20.29 36 9.450±0.178 7.812±0.464 17.33 48 10.340±0.371 9.411±0.447 8.98

表3 不同萃取部位对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响及MTT检测结果（±S，n=5）

表3 不同萃取部位对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响及MTT检测结果（±S，n=5）

注：与正常组对比：#p < 0.05，##p < 0.01；与模型对照组对比：* p < 0.05，** p < 0.01

组别 葡萄糖消耗量/（mmol·L-1） OD值正常对照组 3.833±0.077 0.586±0.063 HepG2/IR 模型组 3.079±0.052#0.501±0.030#0.25 3.842±0.144** 0.459±0.026*二甲双胍组（mg/mL）0.10 4.310±0.085** 0.608±0.063** 0.01 3.596±0.264* 0.594±0.072* 0.001 3.436±0.184* 0.570±0.109 0.25 3.496±0.225* 0.598±0.074*石油醚部位（mg/mL）0.10 3.783±0.074** 0.636±0.095* 0.01 3.256±0.136 0.424±0.086* 0.001 3.131±0.036 0.308±0.091* 0.25 4.254±0.078 ** 0.692±0.061 **乙酸乙酯（ mg/mL）0.10 3.953±0. 055** 0. 587±0.067* 0.01 3.367±0.137* 0.454±0.023* 0.001 3.498±0.197* 0.346±0.076* 0.25 3.996±0.043** 0.643±0.038**正丁醇部位（mg/mL）0.10 3.461±0.180* 0.593±0.065* 0.01 3.348±0.132* 0.466±0.014* 0.001 3.197±0.089* 0.423±0.047*

4 讨 论

胰岛素抵抗参与了Ⅱ型糖尿病的发生和发展的全过程，是T2DM的重要机制之一[9].因此，从胰岛素抵抗的防治着手寻找抗糖尿病的新药是一个重要的方向.肝脏及周围组织是胰岛素作用的靶器官，HepG2 细胞在高浓度胰岛素作用下，HepG2 细胞表面胰岛素受体数目下降程度与胰岛素水平及刺激持续时间呈正相关[2-3].实验结果表明，以10-6mol/L的胰岛素诱导的模型效果较佳，在培养24h后细胞对胰岛素的摄取显著降低，说明了模型的成功.

实验表明，各萃取部位对模型细胞的胰岛素抵抗敏感度各异，模型细胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明显，表明乙酸乙酯部位改善胰岛素抵抗效果最佳.从实验数据可推测：有效范围内的高浓度萃取物对胰岛素抵抗模型细胞的增殖起到促进作用，保护和增强细胞的生命状态免受损伤，以此促进胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗；而低浓度的萃取物则是增强细胞对胰岛素的敏感性，来改善胰岛素抵抗状况，但这有待于进一步的实验证明.

根据试验情况，石油醚萃取部位主要含大量的叶绿素、脂肪烃和少量萜等极性较小的化合物；乙酸乙酯主要含倍半萜类、三萜类、黄酮类等化合物；正丁醇部位主要是苷类化合物，其中活性以乙酸乙酯和正丁醇部位相对较好.从各萃取部位的收率上来说，石油醚部位也远远低于其它2个部位，不是长裂苦苣菜的主要活性部位.可见，长裂苦苣菜萃取部位中改善胰岛素抵抗效果最佳的是乙酸乙酯部位，为长裂苦苣菜在抗糖尿病领域中的应用研究提供了一定的实验依据.

[1] 陆菊明.中国2型糖尿病防治指南（2013年版）更新要点的解读[J].中国糖尿病杂志，2014，22（10）：2-42.

[2] Ma J Z, Yang L X, Shen X L, et al. Effects of Traditional Chinese Medicinal Plants on Anti-insulin Resistance Bioactivity of DXMS-Induced Insulin Resistant HepG2 Cells[J]. Nat Prod Bioprospect, 2014，4（4）：197-206.

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[4] 李英姬.苣荬菜的化学成分与临床应用[J].中国实用医药，2009，4（14）：155-156.

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[9] Samuel V T, Shulman G I. Mechanisms for insulin resistance: common threads and missing link[J]. Cell, 2012，148（5）：852-871.

电子与通信学院学子勇夺“华为网院杯”

2015全国大学生ICT技能大赛桂冠

2015年12月6日“华为网院杯”2015全国大学生ICT技能大赛决赛在深圳圆满闭幕，我校电信学院学生吴惠民与林晓东勇夺桂冠，王隆杰老师获得优秀指导教师奖。本次大赛由华为技术有限公司举办，来自全国29个省市400多所院校、近5000名在校大学生参加。本次大赛取得的成绩不仅表现了我院学生良好的技能水平和职业素养，更体现出我院贯彻“三育人”教育理念取得了实际成果。

（深职院 电子与通信工程学院）

Effect of Bioactive Components from Sonchus Brachyotus D C. on Glucose Metabolism in Insulin Resistant HepG2 Cells

YANG Yanhua1,2, LlN Sujing2*, LlU Xijing2, DU Bin1

（1.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450001, China;
2. School of Applied Chemistry & Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055, China）

The purpose of the present paper is to study the different extraction parts from Sonchus brachyotus D C. on glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells. The model of insulin resistance in HepG2 cells induced high concentrations of insulin. Glucose consumption is tested on petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol extraction. Concentration of 10-6mol/L insulin is found to be the best condition for HepG2 cells 24 h to generate insulin resistance. Compared with model group Hepg2/IR, the Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can reduce the HepG2 / IR glucose consumption. It works especially well on the ethyl acetate extract. The results show that Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can improve the effect of insulin resistance.

Sonchus brachyotus D C.; insulin resistance; HepG2 cell; glucose consumption

R285

A

1672-0318（2016）01-0045-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2016.01.010

2015-06-18

*项目来源：深圳市大规模细胞培养技术与细胞资源库公共技术服务平台（合同号：GGJS20130331152344401）、深圳市科创委2015年基础研究（JCYJ2015 0630 1141 40632）、深圳职业技术学院青年创新基金（2011年）资助项目

杨艳华（1988-），女，河南人，在读硕士，研究方向：天然药用植物的提取分离与纯化.

*通讯作者：林素静（1977-），女，海南人，硕士，副教授，主要研究方向：中药质量控制研究、药物制剂.