任 琴，雷思佳，付秋霞，戴少波，蔡妍琳

（深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055）

中华鳖胚胎发育的观察及温度对胚胎发育速度的影响*

任 琴，雷思佳*，付秋霞，戴少波，蔡妍琳

（深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055）

以中华鳖为研究对象，在温度为25℃、29℃、31℃、32℃和32.5℃，相对湿度75%~90%的孵化环境下，从第8天开始连续解剖并观察了各温度组胚胎发育的过程，列出孵化温度29℃时的胚胎发育分期，根据受精卵胚胎日龄及胚胎形态特征变化，将整个胚胎发育过程分为26期，以头部、四肢、背甲及腹甲的变化作为主要分期依据.同时比较了不同孵化温度下中华鳖胚胎发育的速度，结果表明，25℃不利于受精卵的存活，在上述温度范围内孵化速度随孵化温度的升高而加快.

中华鳖；胚胎发育；分期；孵化温度

大多数龟鳖目动物都具温度依赖型性别决定（temperature-dependent sex determination，TSD）[1-5]，孵化温度是影响受精卵胚胎发育的重要环境因子.对不同发育阶段的胚胎进行分期，不仅为中华鳖繁育研究提供极具价值的信息，更是性别分化研究的基础.国内外关于龟鳖类胚胎发育的研究均有报道，其中对龟类的相关研究相对较多，如拟鳄龟（Chelydra serpentine）[6]、西部锦龟（Chrysemys Picta bellii）[7]、绿海龟（Chelonia mydas）[8]、黄喉拟水龟（Mauremysmutic cacantor）[9]、乌龟（Chinemys Reevesii）[10]、中华条颈龟（Mauremys sinensis）[11]等，而对鳖类的相关研究缺乏系统的研究.

中华鳖（Trionyx sinensis）隶属爬行纲（Reptilia）、龟鳖目（Testudinata）、鳖科（Trionychidae）、鳖属（Pelodiscus），是我国名贵的食用水产动物[12]，其营养丰富可以入药，在国内外市场上十分畅销.本项目以中华鳖作为研究对象，对其胚胎发育过程及胚胎形态学特征进行详细描述，同时记录温度对其胚胎发育速度的影响，以期为中华鳖的繁育以及性别分化研究提供数据参考，同时为中华鳖定向育种提供可靠的技术支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用中华鳖受精卵于2015年7月至8月购自湖南省汉寿中华鳖养殖基地，选取个体较大，受精斑完整且明显的受精卵进行孵化实验.

1.2 受精卵孵化管理条件

受精卵的孵化在恒温恒湿箱（美国，Thermo Fisher 3949，温度控制精度±0.1℃）中进行，实验设置了5个孵化温度：25℃、29.0℃、31.0℃、32℃和32.5℃.本实验采用裸孵的方式进行，将受精卵悬空架于管架上并将管架放置在盛有少量水的盆中，相对湿度为75%~90%.

1.3 受精卵外观观察及胚胎固定

在整个孵化过程中观察受精斑的变化情况，通过光照观察血丝的变化情况并拍照记录.因孵化第1周时相变化很快，且胚胎太小无法对其肉眼观察进行准确判断，故孵化第1周并未进行胚胎采样.从孵化第8天开始每天取数枚受精卵参考文献[9]和文献[13]的方法进行固定，各期取出的胚胎用Bouin’s液固定17~24h后用70%的酒精保存.

2 结果

2.1 中华鳖胚胎发育的分期及依据

主要参考文献[6]的研究结果对中华鳖的发育时相做了重新定义，Yntema提出的龟发育时相划分标准是目前国际上引用最多的龟时相划分标准.根据胚胎日龄及胚胎形态特征变化将整个胚胎发育过程分为26期，主要以头部、四肢、背甲及腹甲的变化作为分期依据.

受精卵在29℃孵化温度下的发育过程如下：

第11期（第8天）:胚体细长稍弯曲，肢芽已出现，眼睛黑色素覆盖不完全.

第12期（第9天）：胚体加粗，弯曲幅度加大，肢芽更明显，眼睛仍未完全黑亮.

第13期（第10天）：胚体呈最大幅度弯曲，肢芽明显可见；头部较大，头突明显，眼睛黑亮；尾部完全向腹侧弯曲蜷缩；胚体内血管较丰富，心跳活跃.

第14期（第12天）：胚体开始拉伸变粗，肢芽明显可见，指板开始形成；背甲雏形开始出现；尾部向腹侧蜷缩一直持续到18期.

第15期（第14天）：背甲出现，其长度约占胚体线轴的1/3；指板发育良好，外周平滑不存在指间凹槽；吻突出现；部分肠道穿过体壁突出体外.

第16期（第16天）：背甲变大，隐约可见背甲肋纹，腹甲雏形开始出现；指板较大，外周平滑出现轻微的指间凹槽；上颚突出较明显，下颚末端到达晶状体水平；肠道突出体外一直持续到22期.

第17期（第18天，图1-17）：背甲长度约占胚体线轴的1/2，背甲肋纹明显，约8对，脊柱明显并有轻微色素沉积，裙边开始出现；腹甲形成更明显；指板四周出现轻微锯齿状突起，头部小于身体部分，眼睛大而突出，下颚末端到达眼睛前端水平，鼻突出现.

第18期（第20天，图1-18）：背甲变宽大，其长度超过胚体线轴的1/2，背甲肋纹明显8对，脊柱明显且色素沉积更多，裙边明显，将尾部全部盖住；腹甲形成更明显；四肢可自由摆动并伴有轻微色素沉积，足趾突出使得指板四周锯齿状突起更深；头部小于身体部分，眼睛大而突出，下眼睑出现，下颚末端延伸远远超出眼睛前端水平，鼻突明显；由于腹甲的良好的形成逐渐遮挡了心脏的跳跃情况.

第19期（第23天，图1-19）：背甲约占胚体线轴2/3，脊柱色素沉积更明显，裙边明显，尾部不再向腹侧蜷缩；腹甲形成良好；四肢色素沉积加深，内侧两个足趾已完全独立张开，外侧三个足趾仍以蹼状相连，且足趾细长明显；头部小于身体部分，脖子可自由伸缩，眼睛大而突出，下眼睑还未到达晶状体水平.

第20期（第26天，图1-20）：背甲长度约占胚体线轴的3/4，背甲色素沉积明显并出现轻微的类似白斑状花纹，裙边明显，尾部可摆动；腹甲形成更明显；四肢灵活可自由摆动且色素沉积加深；头部显著小于身体部分，脖子自由伸缩明显有力，随着上下眼睑的生长，眼睛突出不再明显，眼睛沿脖颈方向及两眼之间的皮肤上出现一条较浅的黑色条纹，下眼睑到达晶状体水平；鼻突明显并向上翘起.

第21期（第29天，图1-21）：背甲色素沉积明显增加，类似白斑状的花纹明显；腹甲形成完好；四肢明显伸长变粗，灵活可自由摆动，四肢内侧背部出现皮肤褶皱，色素沉积加深，内侧三趾末端出现白色指甲，标志着爪子的形成；眼睛沿脖颈方向及两眼之间的皮肤上的黑色条纹明显加深，下眼睑可越过晶状体水平；鼻突明显向前突出且出现明显对称结构.

第22期（第32天，图1-22）：背甲长度约占胚体线轴的4/5，背甲色素沉积明显增加但还并没有接近黑色，四肢内侧背部出现皮肤褶皱增加，色素沉积加深，爪子更为粗长而明显；脖子自由伸缩明显有力，眼睛逐渐被眼睑覆盖而表现的不再突出；卵黄逐渐被胚体吸收，其大小与胚体相当.

第23期（第36d，图2-23）：背甲白斑开始消失，黑色斑点出现，随着背甲色素沉积的增多肋骨已看不见，腹部肚脐处肠道已缩回体内只残留卵黄囊；四肢明显变粗伸长且有力，可爬行，内侧背部皮肤褶皱加深，色素沉积加深；眼睛上下眼睑可完全闭合；与22期相比个体增大约1/2，整体很灵活，并可自行翻转身体，身体稍大于卵黄大小.

图1 胚胎分期（第17~22期）

第24期（第40d，图2-24）：身体整体的色素加深，背甲上之前的白斑已基本消失，黑色斑点明显，肋骨已看不见；脐突出并包含部分卵黄囊，卵黄逐渐被吸收进体内；整体非常灵活，身体明显大于卵黄大小.

第25期（第44d，图2-25）：形态特征与孵出的稚鳖基本一致，仅存少量卵黄未被吸收，个别胚胎已开始提前孵出.

第26期（第48d，图2-26）：出壳：稚鳖头部以及前肢撑破卵壳，卵黄全部被吸收，腹甲下方留下一个较小的脐孔，但也有少数个体残留相对较小的卵黄囊.

图2 胚胎分期(第23~26期)

2.2 温度对中华鳖胚胎发育速度的影响

本实验共设置5个孵化温度：25℃、29℃、31℃、32℃和32.5℃，从第8天开始每天取数枚受精卵进行受精卵外观及胚胎外观观察，判断发育时相并记录相应的孵化日龄，各温度下受精卵胚胎发育分期见图3.25℃环境下受精卵孵化至第42天（第21期）时已全部死亡；孵化温度为29℃时受精卵孵化最短用时45 d，最长用时61 d；31℃环境下受精卵孵化最短用时42 d，最长用时58 d；32℃环境下受精卵孵化最短用时40 d，最长用时57 d；32.5℃环境下受精卵孵化最短用时39 d，最长用时53 d.结果表明，温度过低受精卵无法存活，而高温能加快中华鳖的胚胎发育速度.同时从图3可以看出，胚胎发育前期不同孵化温度下的时相差异并不明显，而在胚胎发育至第18期以后，差异逐渐加大.

图3 温度对中华鳖胚胎发育速度的影响

3 讨 论

3.1 关于龟鳖类胚胎发育的分期与比较

目前国内外已有不少关于龟鳖类胚胎发育分期的研究报道，但由于所采取的分期依据及标准不同，将龟鳖类各个物种的分期期数分为23~31期不等.迄今为止，报道的分期标准主要有孵化胚胎日龄、胚胎大小、胚胎形态特征和/或内部组织器官发生变化[7,8,10,12,15]，其中，文献[6]关于龟发育时相的划分方法被国际上公认为时相划分标准.本实验中，主要参考文献[6]的分期方法，以受精卵外观、胚胎日龄及胚胎形态特征变化为依据将中华鳖胚胎发育分为26期，但由于本项目是从孵化第8天开始取样观察，因此还有待进一步完善中华鳖胚胎发育的整个过程.由于大多数温度性别决定型的龟鳖类性别分化的敏感期在15期以后，本文提供了11~26期比较详细的特征参数，为中华鳖性别分化及其性别调控研究提供了较为详细的基础资料.

已有研究表明，龟鳖类不同物种间的主要器官，如心脏、尾部、四肢、背甲和腹甲出现的先后顺序均一致，但所需时间的长短不一，且在胚胎发育早期各器官发育同步性较高，而在胚胎发育中后期差异逐渐变大[6,7,9,13,14].另外，结合孵化过程中的孵化温度、湿度及其他环境因子的影响，使得各物种间的胚胎发育分期不尽相同，给不同物种之间的比较研究带来一定的困难.因此，Greenbaum[15]提出在胚胎发育过程中选择易于观察、相对明显且保守的胚胎形态特征（如前肢变化）作为分期标准，可以更好地减少种间差异性.

3.2 温度对胚胎发育的影响

孵化温度是龟鳖类性别分化的重要环境影响因子[16]，同时也是影响其孵化进程的重要因素.本实验研究结果表明，低温组（25℃）受精卵全部死亡，而随着孵化温度的升高，孵化时间逐渐减少，这与文献[17-19]的研究结果基本一致.另外，从图3可以看出各温度下中华鳖胚胎发育分期在发育后期差异逐渐拉开，说明孵化温度对中华鳖胚胎发育后期的影响更显著.因此，了解温度对中华鳖胚胎发育的影响，不仅为中华鳖性别分化研究奠定基础同时对中华鳖养殖户来说，通过人为控制孵化温度，在不影响受精卵存活及孵化后稚鳖生长的情况下，可以合理调整孵化温度，缩短孵化周期以获得最大的经济效益.

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Observation on the Embryonic Development of Soft-shell Turtle Pelodiscus sinensis and the Effect of Incubation Temperature on Embryonic Development Speed

REN Qin, LEl Sijia*, FU Qiuxia, DAl Shaobo, CAl Yanlin

（School of Applied Chemistry and Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518000, China）

The incubation experiment of Pelodiscus sinensis has been conducted under the temperature of 25℃, 29℃, 31℃, 32℃ and 32.5℃, with a relative humidity of 75%~90%. From the eighth day on, we dissected and observed the process of embryonic development continuously. When the incubation temperature was at 29℃, the embryonic development was divided into 26 stages according to the appearance of fertilized eggs, embryo daily age and morphological characters. Every stage was mainly determined by the changes of head, limbs, carapace and plastron. Comparing the speed of embryonic development at different temperatures, the result shows that it is not conducive for the fertilized eggs to survive at 25℃ and the hatching speed increases with the rising incubation temperature.

P. sinensis; embryonic development; stages; incubation temperature

S966.5

A

1672-0318（2016）01-0040-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2016.01.009

2015-11-18

*项目来源：深圳市科信委（ZYA201007060092A）；深圳市科创委（CXZZ20130517145458599）；广东大学生科技创新培育专项基金（pdjh2015b0779）资助项目

任琴（1989-），女，湖南岳阳人，理学硕士，助教，研究方向：水产动物生理学.

*通讯作者：雷思佳（1964-），女，湖南津市人，理学博士，教授，研究方向：水产动物生理生态学.