宋慧芳，李应龙，马恩波，张建珍



飞蝗--乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

宋慧芳1,2,3，李应龙1,2,3，马恩波1,3，张建珍1,3

（1山西大学应用生物学研究所，太原 030006；2山西大学生命科学学院，太原 030006；3农业有害生物综合治理山西省重点实验室，太原 030006）

【目的】-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（--acetylglucosaminidase，NAG）是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析，探究该酶在飞蝗（）生长发育过程中的生物学功能，为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据的cDNA全长序列（GenBank: JX888720.1）设计包含酶切位点HI、dIII和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段，双酶切后连接至pFastBacTM-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上，用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带，挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒（baculovirus plasmid，Bacmid）。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾（）卵巢细胞系Sf9中，72 h内连续观察细胞形态，当出现感染迹象后收集细胞，离心，取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞，裂解并提取蛋白，western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞，提取蛋白，利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化，取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp全长的pFastBac-重组质粒，酶切验证与目标条带一致。……