马双新，刘 宁，贾 慧，戴冬青，许苗苗，曹志艳，董金皋



玉米大斑病菌漆酶基因结构分析及原核表达

马双新，刘 宁，贾 慧，戴冬青，许苗苗，曹志艳，董金皋

（河北农业大学河北省植物生理与分子病理学重点实验室，河北保定 071001）

【目的】对玉米大斑病菌（）漆酶基因进行生物信息学分析，推测其蛋白功能，探究木质素降解过程中产生的小分子物质对表达的影响，并对其进行克隆及原核表达，以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070 ()基因的全序列，通过ClustalX与马尔尼菲青霉菌（）(PMAA_082060)基因、烟曲霉（）(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌（）(AN6635) 基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对，查看中的铜离子结合位点，利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测，通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测，采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响；利用RT-qPCR方法分析小分子物质对表达规律的影响；采用原核表达系统，以pET-30a表达载体为框架，对其进行原核表达，并将表达蛋白纯化，以ABTS为底物，420 nm下检测漆酶活性。【结果】具有典型的Cu离子结合位点，与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中-螺旋、延伸链、-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%，分子量为61.64 kD，等电点为5.00，平均疏水性为-0.37，表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L-1香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时，玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸＞香兰素＞4-羟基苯甲醛＞4-羟基苯甲酸＞丁香醛＞对照。……