李善姬，杜超，刘敏，张洋婷，时念秋，梁承武

（吉林医药学院，吉林吉林132013）

枳椇水提液不同极性萃取组分对乙醇诱导的人体HL7702肝细胞脂肪变性的影响

李善姬，杜超，刘敏，张洋婷，时念秋，梁承武

（吉林医药学院，吉林吉林132013）

探讨枳椇水提液不同极性萃取组分对乙醇诱导的人体HL7702肝细胞脂肪变性的影响。体外培养人正常肝细胞株HL7702，设立空白对照组、乙醇模型组和枳椇不同极性萃取液干预组，采用MTT法测定细胞存活率，油红O染色观察细胞内脂滴形成情况，检查细胞内TG、ALT和AST的含量。结果0.6%乙醇诱导HL7702细胞24 h成功建立脂肪变性模型。同空白对照组相比，乙醇模型组细胞内TG、ALT和AST含量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；同模型组比，枳椇乙酸乙酯层萃取液干预的细胞TG、ALT和AST含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：具有减轻乙醇细胞损伤和降低肝细胞脂肪变性作用的最佳组分是乙酸乙酯萃取层。

酒精性脂肪肝；枳椇；萃取

酒精性脂肪肝病（AFLD）是指长期大量饮酒导致肝细胞内脂肪蓄积量不断增多，单位面积上有30%的脂肪形成或超过肝湿重5%，就可以称之为肝细胞的脂肪变性。一些地区流行病学调查发现，我国成人酒精性肝病的患病率在4%左右［1］，并且具有逐年上升的趋势。因此，酒精性脂肪肝越来越受到人们的关注。乙醇对肝脏的损伤机制尚未完全阐明，但酒精型肝炎动物模型的试验结果和临床结果均表明［2］：乙醇及其代谢产物对肝脏的损伤、细胞因子、免疫因素、自由基和内毒素在发病过程中扮演者不可替代的作用。因此全面清除自由基和内毒素可以保护肝脏免受损伤。

枳椇（Hovenia acerba）为鼠李科，枳椇属，始载于《唐本草》，自古以来就是一味解酒良药。动物实验表明［3-4］，枳椇水提液对急性酒精中毒和酒精性脂肪肝有明显的治疗作用，对各种原因所导致的肝损伤有明确的保护和促生长作用，且有可能延缓和防止乙醇所致的脂肪肝的形成。目前，国内外对枳椇解酒保肝作用的研究主要集中在单一的枳椇水提液干预动物实验，对于枳椇水提液解酒保肝的有效成分的研究相对较少。因此，本试验通过研究枳椇萃取液的不同极性组分对乙醇诱导人体HL7702肝细胞脂肪变性的影响，为枳椇的解酒保肝活性成分的研究提供初步线索。

1材料与方法

1.1细胞系人正常肝细胞株HL7702，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2受试物北枳椇的果实和果梗在75℃条件下水提3次，合并提取液浓缩后，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液浓缩后得到浸膏，进一步冻干后得到供试品。

1.3主要试剂RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO，购自美国GIBCO公司；MTT，购自美国Sigma公司；甘油三酯测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，购自上海岚派生物技术有限公司。

1.4方法

1.4.1乙醇作用浓度的选择取对数生长期HL7702细胞接种于96孔板内，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100 μL细胞悬液。待细胞均匀铺满孔底，分别加入无水乙醇（终浓度为0.1%、0.3%、0.6%、1.2%、2.4%和3.6%），设10个平行孔，置于37℃、5%CO2孵育箱内培养48 h。进行MTT试验和油红O染色试验。

1.4.2试验分组根据MTT结果选择0.6%乙醇诱导HL7702细胞48 h，建立肝细胞损伤模型。本试验共分为11组，分别为空白对照组（N）、乙醇模型组（A）、枳椇水提液组（A+H）、枳椇乙酸乙酯层萃取液（A+E）低剂量组、枳椇乙酸乙酯层萃取液（A+E）高剂量组、枳椇石油醚层萃取液（A+P）低剂量组、枳椇石油醚层萃取液（A+P）高剂量组、枳椇正丁醇层萃取液（A+B）低剂量组、枳椇正丁醇层萃取液（A+B）高剂量组、枳椇水层萃取液（A+W）低剂量组、枳椇水层萃取液（A+W）高剂量组。

1.4.3枳椇不同极性提取物对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞增殖的影响取对数生长期HL7702细胞接种于96孔板内，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100 μL细胞悬液。待细胞均匀铺满孔底，加入终浓度为0.6%的无水乙醇，置于37℃、5%CO2孵育箱内培养48 h。设10个平行孔，进行MTT试验。

1.4.4细胞内TG、ALT和AST的检测将处于对数生长期的HL7702细胞用0.25%胰酶消化后，调细胞浓度至5×104个/mL，接种于24孔培养板，每孔1 mL细胞悬液。待细胞生长至80%融合时，用0.6%乙醇进行诱导干预，继续孵育48 h后对试验组给予相应剂量的受试物，干预细胞48 h。收集细胞，按照TG、ALT和AST试剂盒说明书进行操作。

1.5统计学处理用SPSS 19.0 for Windows统计学软件处理。检测数据以均数±标准差（±s）表示，各组均数间比较前先进行正态性及方差齐性检验，如符合方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，处理前后两组间比较采用配对样本t检验方法，选定P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度乙醇干预HL7702肝细胞48 h后MTT检测结果由表1可知，当乙醇浓度为0.1%、0.3%时，OD值较对照组稍增高，细胞活性均在100%以上，显微镜下观察细胞形态发现，细胞形态和对照组相比无明显改变，生长良好；当乙醇浓度为0.6%、1.2%时，OD值较对照组稍下降，细胞形态稍有增大，生长正常；当浓度增至2.4%、3.6%时，OD值下降较明显，肝细胞体积明显增大，悬浮漂起的细胞增多，细胞存活率明显下降。

表1不同浓度乙醇对HL7702肝细胞增殖的影响（-X±s，n=10）

2.2细胞油红O染色结果选择乙醇浓度为0.6%和1.2%进行细胞油红O染色。结果如中插彩版图1所示：空白对照组细胞形态正常，长势良好，胞浆内无脂滴形成；0.6%乙醇组细胞内脂滴颗粒呈连珠状排列，界限清楚，均匀分布；1.2%乙醇组细胞内脂滴颗粒较多，但脂滴皱缩、颗粒之间界限模糊，排列杂乱无序，部分细胞甚至出现胞膜破裂，脱壁细胞也明显增多。因此，选用0.6%乙醇作为脂肪性酒精肝造模浓度。见前插彩版图1。

2.3枳椇不同极性提取物对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞增殖的影响由表2可知，只有乙酸乙酯层（A+E）组的细胞活性略高于乙醇模型组（A），其他组别的细胞活性均低于乙醇模型组（A）。其中，随着乙酸乙酯剂量的增加，细胞活性也逐渐增加。由此可以推断：枳椇乙酸乙酯层具有拮抗酒精的作用，而且其作用强度与剂量成正相关。

表2枳椇不同极性提取物对酒精诱导的脂肪变性肝细胞增殖的影响（-X±s，n=10）

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2.4各组细胞内TG含量检测结果试验结果如表3所示，与正常组（N）相比，乙醇模型组（A）的TG含量明显增加，且差异有统计学意义（P＜0.05）；与乙醇模型组（A）相比，枳椇水提液（A+ H）组和乙酸乙酯层（A+E）组的TG含量均降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯层（A+E）低剂量组和高剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明在一定浓度范围内，乙酸乙酯层（A+E）受试物具有降低TG的作用。

表3不同浓度的枳椇不同极性提取物组细胞TG含量（-X±s，n=10）

2.5细胞培养基内ALT、AST检测结果由表4可知，乙醇模型组（A）中ALT、AST的泄漏量增加，与正常组（N）相比差异有统计学意义（P＜0.05），与乙醇模型组（A）相比，枳椇水提液（A+ H）组和乙酸乙酯层（A+E）组的ALT、AST泄露量有所降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯层（A+E）低剂量组和高剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明在一定浓度范围内，乙酸乙酯层（A+E）受试物具有降低ALT、AST的作用。

表4对照组内ALT、AST的泄漏量（-X±s，n=5）

3讨论

酒精性肝病（ALD）是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病。随着社会经济的发展，饮酒人数和人均饮酒量呈现逐年上升的趋势，酒精滥用和酒精依赖已成为公共卫生问题［5］。ALD的防治措施主要有戒酒、中药治疗、应用降脂药物等，目前动物试验已经证实了枳椇水提液具有防治ALD的功效。

本试验显示，用0.6%和1.2%干预时细胞形态稍有增大，生长良好，存活率＞80%。与王春晖等［6］研究的乙醇干预浓度基本一致，可初步选择0.6%、1.2%的乙醇浓度作为造模浓度。根据光镜结果最终选用0.6%乙醇作为脂肪性酒精肝造模浓度。试验结果再次验证了枳椇水提取液具有解酒保肝的功效，这与郭感恩［7］的研究结果基本一致。进一步研究发现，枳椇乙酸乙酯层萃取液对酒精诱导的脂肪变性肝细胞起防治作用，这与时涛［8］等大鼠试验结果相一致。对各组细胞内TG含量、ALT和AST泄漏量的检测结果显示，枳椇乙酸乙酯萃取层具有减轻乙醇肝细胞损伤和降低肝细胞脂肪变性作用。此试验结果和谢蓉蓉等［9］的体内小鼠试验结果几乎一致，充分证实了枳椇乙酸乙酯层萃取液的解酒保肝作用，即使在酒精存在的情况下依旧对肝脏起保护作用，其中包括可以促进酒精诱导的脂肪变性肝细胞的增殖及减轻酒精引起的脂肪变性。

枳椇乙酸乙酯层萃取液为复合物质，真正发挥解酒保肝作用的单体成分仍需要我们进一步的试验证实及探讨。本试验结果为后续的单体研究提供初步线索。

［1］孙艳，吴阳.酒精性肝病的研究进展［J］.吉林大学学报，2006，32（4）：733-736.

［2］Hoek J B，Pastorino J G.Ethanol，oxidative stress and cytokine 2 induced liver cell injury［J］.Alcohol，2002，27（1）：63-68.

［3］嵇扬，李俊，杨平.枳椇子对急性酒精中毒的作用［J］.中药材，2001，24（2）：126-127.

［4］丁静.枳椇子预防大鼠酒精性脂肪肝的实验研究［J］.浙江中西医结合杂志，2007，17（3）：156-158.

［5］孙艳，吴阳，刘兵，等.酒精性肝病的研究进展［J］.吉林大学学报（医学版），2006，32（4）：733-736

［6］王春晖.软脂酸对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞的影响［D］.长沙：中南大学，2011.

［7］郭感恩.枳椇子水提取液对乙醇体外诱导脂肪变L-02细胞Adipor2基因表达的影响（D）.长沙：中南大学，2011.

［8］时涛，陈振德.枳椇子乙酸乙酯提取部位的解酒作用研究［J］.中国药房，2009，20（18）：1378-1379.

［9］谢蓉蓉，张德志，庞小雄，等.枳椇子乙酸乙酯部位化学成分的研究［J］.亚太传统医药，2012，8（9）：27-28.

Effects of different polar extraction layer of Hovenia acerba on human HL7702 fatty degeneration cells induced by ethanol

LI Shan-ji，DU Chao，LIU Min，ZHANG Yang-ting，SHI Nian-Qiu，LIANG Cheng-wu
（Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

To determine the effects of polar extraction layer of Hovenia acerba at different concentrations on alcohol-induced lipogenesis in HL7702 liver cells.Cultured HL7702 liver cells were divided into eleven groups：blank control group，alcohol induction group，and polar extraction layer of Hovenia acerba intervention groups.Cell proliferation was measured by MTT assay.The accumulation of lipid droplets was observed by light inverted microscopy after red oil-O staining.The levels of TG，ALT and AST were determined using ELISA kits.A model of alcohol-induced steatosis was successfully induced in HL7702 liver cells by incubation with 0.6%ethanol for 24 h.Compared with normal group，ALT，AST and TG were increased in alcohol induction group，and difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with alcohol induction group，the liquid Hovenia dulcis and ethyl acetate extract layer intervention ALT、AST and TG were significant decreased（P＜0.05）.The Ethyl acetate extraction layer can relieve ethanol cell damage and reduce the hepatocyte fatty degeneration in HL7702 fat cell induced by ethanol.

Alcoholic fatty liver；Hovenia acerba；Extraction

LIANG Cheng-wu

R 285

A

0529-6005（2016）08-0056-03

2016-04-13

吉林省卫生厅科技项目（2014Z106）

李善姬（1969-），女，副教授，博士，研究方向为活性成分的生理功能与机制，E-mail：shanji@hotmail.com

梁承武，E-mail：medchem@sina.com