骆晓蕾，郭龙军，谷伟红，冯力，王玉娥

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）

紧密连接蛋白occludin和claudin-1在猪机体不同组织的分布研究

骆晓蕾，郭龙军，谷伟红，冯力，王玉娥

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）

紧密连接蛋白有维持上皮屏障完整性的功能，主要的组成蛋白有occludin和claudin-1。为研究猪体内紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达分布情况，首先用GenBank中发表的猪源occludin和claudin-1的序列，设计并合成了针对occludin和claudin-1的特异性引物，然后从无特定病原（SPF）猪体不同组织中提取总RNA，反转录成cDNA，用半定量方法测定SPF猪不同组织紧密连接蛋白的mRNA水平。结果发现，occludin和claudin-1在不同组织的分布存在差异。进一步测序发现，occludin序列相对保守，而claudin-1则变异较大。

紧密连接蛋白；claudin-1；occludin

紧密连接蛋白是广泛存在于上皮细胞和内皮细胞之间的细胞连接复合体［1］，其功能是封闭细胞间隙，阻止上皮层内外物质的自由进出，是上皮细胞选择通透作用的物质基础，紧密连接蛋白在生理状态下通过调控作用，能有效的阻止肠腔内细菌、毒素等物质的胞旁转运，维持上皮屏障功能的完整［2］。紧密连接蛋白为多种蛋白相互作用下形成的复合结构［3］，主要由跨膜蛋白和胞质蛋白组成，其中主要跨膜蛋白有occludin和claudin-1等，occludin和claudin-1都是四次跨膜蛋白，有两个胞外环，结构十分相似［4］。occludin是第一个被发现的膜内紧密连接蛋白，其在细胞膜上分布最广，在细胞间主要发挥粘附分子的作用，具有维持和调节紧密连接蛋白屏障功能［5］。紧密连接蛋白另一个重要的组成蛋白claudins是一个多基因家族，不同的claudins成员在不同的组织细胞中的分布和功能具有差异性，主要有细胞信号转导和调节细胞连接处选择渗透性的功能［6］。紧密连接蛋白表达及分布的异常与很多疾病都相关，occludin和claudin-1功能的多样性也许与他们的组织特异性有关，目前还没有关于occludin和claudin-1在正常猪体不同组织分布情况的研究，本研究主要检测了这两种紧密连接蛋白在猪体不同组织分布情况，为occludin和claudin-1在不同组织的功能研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1试验试剂Golden MLV Reverse Transcriptase，购自海基生物科技有限公司；T4 DNA连接酶、TaKaRa LA Taq和Premix Taq，均购自于TaKa-Ra生物科技有限公司；胶回收试剂盒和质粒小剂量提取试剂盒，购自于AXYGEN公司；LB、PBS试剂为自己实验室配制；琼脂，购自于BIOWEST公司。

1.2实验器材电子天平，购自Sartorius公司；PCR仪器，购自SENSQUEST公司；小型离心机、和-80冷藏箱，均购自Thermo公司；DK-8D型电热恒温水箱是由上海一恒科技有限公司生产；医用冷藏箱、医用低温保存箱，均购自海尔公司；Allegra X-22R离心机，购自BECKMAN公司；HDL洁净工作台由北京哈文制造公司制造；生化培养箱，购自Blue pard公司；WD-9405B型水平摇床、DYY-6C型电泳仪，购自北京六一仪器厂；UV tuansilluminator，购自WEALTEC公司。

1.3RNA的提取取SPF猪的肝、心、脾、肺、肾等15种不同组织加PBS研磨后将组织研磨混合液放-80℃储存后反复冻融3次，取不同组织研磨液提取总RNA，置-80℃保存。

1.4RNA的反转录以SPF猪不同组织的总RNA为模板，Oligo d（T）为引物反转录获得cDNA，反转录体系为20 μL，其反应体系及反转录条件如表1所示，反转录所得的cDNA可直接用于PCR反应。

1.5引物设计和PCR扩增根据GenBank中的猪源occludin和claudin-1全长序列设计特异性引物（表2），以提取的猪不同组织总RNA反转录得到的cDNA为模板扩增occludin和claudin-1的编码序列，PCR产物纯化回收后克隆到pMD18-T载体上，经过PCR和双酶切鉴定为阳性的重组质粒由上海华大基因科技股份有限公司测序验证。

表1cDNA反转录体系及反应条件

表2PCR引物

1.6半定量PCR法测定occludin和claudin-1在猪不同组织的分布情况根据全长序列，用Oligo 7软件设计occludin和claudin-1的定量引物以及内参β-actin如表3所示，并根据半定量PCR的方法测定这两种蛋白在猪不同组织中的mRNA水平。猪的不同组织分别取自3只不同的SPF猪，试验结果均独立重复3次而得出，试验结果用软件Image J进行分析。

表3定量PCR引物

2结果

2.1用半定量RT-PCR测定occludin和claudin-1在猪不同组织中的mRNA水平从SPF猪不同组织，如肝、心、脾、肺、肾、不同肠段等，分别提取RNA，反转录成cDNA，用设计的特异性针对occludin、claudin-1以及内参β-actin的定量引物以cDNA为模板进行半定量PCR，结果表明，occludin和claudin-1在不同组织的分布存在差异。紧密连接蛋白occludin在肝、脾、肺、脑、十二指肠、回肠、腮腺等组织中含量较高，在淋巴结和胸腺中含量较低，claudin-1在肝、肺、肾、十二指肠、腮腺中含量较高，在淋巴结和胸腺中含量较低。以上结果表明，两者均在部分肠段和一些实体组织，如：肝、肺、肾等组织中mRNA水平较高，在淋巴结和一些腺体等免疫组织中含量较低。见图1和图2。

2.2猪源不同组织中occludin和claudin-1全长序列比对结果从SPF猪体不同组织，如肝、心、脾、肺、肾、不同肠段等，分别提取RNA，反转录成cDNA，用设计针对occludin和claudin-1的全长引物扩增这两种蛋白的编码序列，并克隆到pMD18-T上，经测序结果发现，occludin在猪体不同组织的分布相对保守，与GenBank中的序列无明显差别，而claudin-1则变异较大，如图3所示，在小肠和肝、脾等一些组织，claudin-1序列的第252个碱基G被替换成了A，第255位和257位碱基A和T分别被替换成了G和C，第298位和297位碱基T和G分别被替换成了C和A，第310位碱基T被替换成了A，并且在小肠和肝、脾、心、腮腺和淋巴结中存在部分碱基的缺失，这可能是claudin-1存在不同组织的突变体，这些突变体也许与claudin-1的组织特异性和功能有关。

图1occludin在猪体不同组织的分布情况

图2为claudin-1在猪体不同组织的分布情况

3讨论

紧密连接蛋白创造了细胞转运屏障，具有维持细胞完整性的功能，紧密连接蛋白的异常表达可以增加细胞膜的渗透性，从而引起肠道等器官的疾病以及系统性疾病［7］，因此紧密连接蛋白的正常表达对于机体的生存至关重要。有研究表明，在正常情况下，紧密连接蛋白是构成血脑屏障的重要组分，而occludin是大脑内皮细胞的重要组分，维持血脑屏障的完整性，在人脑自发性颅内出血的研究中，循环的和血液中的occludin表达水平明显升高，因而occludin成为诊断该疾病的一个重要的生物指标［8］；在各种癌症中，与正常组织相比claudin-1的表达水平发生改变，而这种改变可以诊断一些癌症的复发，因此，claudin-1可作为诊断癌症复发的因素和药物治疗靶点［9］。有关人的紧密连接蛋白表达水平与疾病的联系越来越多的被发现，而猪源的很少研究和报道，所以检测正常猪体中紧密连接蛋白在不同组织中的正常水平可以为以后进一步的功能研究奠定基础。本研究表明，occludin在猪体各个组织中的存在形式比较保守，而在各个组织中的mRNA水平存在差异，说明occludin在各个组织中功能的差异也许与它的含量存在一定的联系；claudin-1在猪体各个组织中的含量和序列存在形式都存在差异，说明claudin-1在各个组织的功能也许不仅与它的含量有关，还与它的存在形式有关。occludin和claudin-1在免疫细胞丰富的淋巴结和胸腺中的mRNA水平较低，在免疫细胞较少的肝、脾、肾和脑等一些实体组织中的含量较高，说明紧密连接蛋白在这些实体组织中也许补偿了免疫细胞的一些功能，对机体发挥着重要的屏障作用。

图3猪不同组织中全长claudin-1的测序结果

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Thedistribution of tight junction proteins occludin and claudin-1 in porcinedifferent tissues

LUO Xiao-lei，GUO Long-jun，GU Wei-hong，FENG Li，WANG Yu-e
（State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

Tight junctions are highly specialized membrane domains，which maintain the integrity of the epithelial barrier.The main components of tight junction proteins include occludin and claudin-1.To study the distribution of occludin and claudin-1 in porcine tissues，we designed specific primers according to the published sequences in GenBank.Total RNA was extracted from different SPF pig tissues，and then semi-quantitative RT-PCR was performed to measure both occludin and claudin-1 transcripts level from different porcine tissues.The results showed that the distribution of occludin and claudin-1 in porcine tissues was different. Full-length sequencing revealed that occludin was highly conserved among different tissues，while claudin-1 showed relative differences in tissue distribution.

Tight junction portines；occludin；claudin-1

WANG Yu-e

R 730.2

A

0529-6005（2016）08-0021-04

2016-01-18

国家自然科学基金面上项目（31572497）；黑龙江省自然科学基金项目（LC201418）

骆晓蕾（1989-），女，硕士，主要从事动物疫苗与分子免疫学研究，E-mail：1203765310@qq.com

王玉娥，E-mail：wangyue@caas.cn