于丽 曾桢 李婷 廖秦平

【摘要】目的：检测子宫内膜癌组织中孕激素受体膜成分1（PGRMC1）的蛋白表达特点，分析其临床意义；并探讨PGRMC1对子宫内膜癌细胞增殖调控的影响。方法：采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测70例子宫内膜癌组织及28例对照子宫内膜组织中PGRMC1蛋白表达水平；应用细胞免疫组化方法检测三种人子宫内膜癌细胞系中PGRMC1的表达定位；将PGRMC1的小分子抑制剂Ag205以不同浓度分别刺激人子宫内膜癌细胞Ishikawa、Hec-1A、KLE 72小时，应用CCK-8（cell counting kit 8）方法检测Ag205对细胞活力的影响。结果：子宫内膜癌组织中PGRMC1表达较正常内膜显著升高（P=0.038）；PGRMC1在各期子宫内膜癌组织中的表达无差异，但在Ⅰ期患者中，PGRMC1在Ⅰa期表达较Ⅰb期显著高（P=0.019）；PGRMC1表达与子宫内膜癌组织中ER表达水平相关（P=0.015），但与分化程度、淋巴结转移及脉管癌栓无关，与 PR、p53、Ki-67及bcl-2表达亦无显著相关性；20μM Ag205显著抑制三种子宫内膜癌细胞的增殖活力，其中以KLE细胞的抑制作用最明显，从最低浓度（5μM）即出现抑制效应，并随浓度增加抑制作用逐步增强。结论：子宫内膜癌内膜中PGRMC1表达显著增高；增高的PGRMC1参与调控子宫内膜癌细胞的增殖活性。

【关键词】子宫内膜癌；孕激素受体膜成分1；增殖活力；蛋白质免疫印迹法

The expression of PGRMC1 in endometrial cancer andits effect on endometrial cancer cell proliferationYU Li， ZENG Zhen， LI Ting， LIAO Qinping△. Department of Obstetrics and Gynecology， Peking University First Hospital， Beijing 100034， China

【Abstract】Objectives： To investigate the expression pattern of progesterone receptor membrane component 1 （PGRMC1） in endometrial carcinoma （EC）， and evaluate the probable role of PGRMC1 in the proliferation of endometrial cancer cells. Methods： 70 endometrial cancer tissues and 28 noncancerous endometrial tissues were collected as experimental group and control group respectively. The expression of PGRMC1 was detected by Western blot. Three endometrial cancer cell lines were cultured in vitro， then the expression location of PGRMC1 were tested by immunohistochemistry. The cell viability was detected by CCK-8 after treatment with Ag205 for 72 hours individually， which was the specific inhibitor of PGRMC1. Results： The expression of PGRMC1 was significantly higher in EC patients than control group （P=0.038）. There was no difference among different stages， but the expression of PGRMC1 was significantly higher in patients with stage Ia than stage Ib （P=0.019）. In endometrial carcinoma the increase of PGRMC1 was detected in those with high ER status （P=0.015）. PGRMC1 expression had no relationship with lymph node metastasis or vascular invasion， and was unrelated to the expression of PR， p53， Ki-67， bcl-2. The proliferation of three endometrial cancer cell lines was all heavily inhibited by 20μM Ag205. In KLE cells Ag205 showed the strongest growth repression， since from 5μM the repression effect began to appear. Conclusion： The expression of PGRMC1 is significantly higher in EC patients than that in control group. The over-expression of PGRMC1 in endometrial carcinoma may play a role in the proliferation activity of endometrial cancer cells.

【Key words】Endometrial carcinoma； Progesterone receptor membrane component 1 （PGRMC1）； Proliferation activity； Western blot

【中图分类号】R737.33【文献标志码】A

子宫内膜癌是女性生殖道常见恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，子宫内膜癌的发病率已经超过子宫颈癌和卵巢癌发病的总和，成为严重威胁女性健康的疾病[1]。子宫内膜癌发生及恶性进展与雌、孕激素作用失衡密切相关，近年来研究发现性激素能够通过不依赖其核受体的非基因组效应调控细胞增殖、凋亡及侵袭等功能，对于肿瘤的发生与发展起重要作用，由此发现一系列肿瘤相关分子，孕激素受体膜成分1（Progesterone receptor membrane component 1，PGRMC1）即是其中一员[2]。PGRMC1在介导孕激素的非基因组效应中发挥重要作用，在体内参与卵泡发育、精子的顶体反应等生理过程[3， 4]；其还能够与血红素直接结合激活细胞色素P450参与调节体内类固醇、药物代谢及性激素的合成[5]；此外多种肿瘤中均发现PGRMC1表达异常，因此明确PGRMC1在子宫内膜癌中的分布及其功能有助于丰富内膜癌的病因学研究。本文将检测PGRMC1在人子宫内膜癌组织中的表达特点，分析PGRMC1对子宫内膜癌细胞生长的影响，初步探讨PGRMC1在子宫内膜癌发生进展中的作用。

1材料来源

1.1人子宫内膜癌组织留取

回顾性选取2001年至2010年就诊于我院妇产科并接受手术治疗的70名子宫内膜癌患者。排除术前已发现远隔转移、术中术后明显并发症影响患者远期生存、肿瘤切缘阳性的患者。了解所有患者的年龄、是否绝经、手术方式、肿瘤分期、肿瘤分化、淋巴结状态、是否存在脉管癌栓等信息。选取同期因其他疾病就诊，行子宫切除术或分段诊刮术、术后病理证实子宫内膜为正常或为良性病变的28例患者。所有子宫内膜组织术前均无激素应用史。将子宫内膜组织在术后半小时内取得并明确标记后放入冻存管于液氮中过夜后移至-80℃冰箱中长期保存。所有内膜组织取材均经患者知情同意。

1.2样本保存

人子宫内膜癌细胞Ishikawa、Hec-1A、KLE由我院妇产科实验室保存。

1.3主要试剂

RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、30%丙烯酰胺、SDS-PAGE电泳缓冲液、电转移液及封闭-洗涤缓冲液（TBST）等试剂均购自于北京普利来基因技术有限公司。兔抗PGRMC1多克隆抗体购自于英国PROTEINTEC公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体、HRP标记抗兔和抗小鼠二抗购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。CCK-8（cell counting kit 8）试剂盒购于日本同仁化学研究所。Ag205 购于TIMTEC公司，溶于DMSO中配成40mM储液，随后用DMSO稀释成不同浓度的1000×储液，加药刺激前用含0.5%活性炭处理FBS的无酚红DMEM/F-12稀释为工作液，浓度分别为0.1%DMSO、5μM Ag205、10μM Ag205、20μM Ag205、40μM Ag205。

2方法

2.1蛋白印迹法（Western Blot）检测PGRMC1蛋白的表达水平

子宫内膜癌及正常对照子宫内膜组织按常规方法提取总蛋白，参照BCA试剂盒步骤测定总蛋白浓度，与2×Loading buffer混合变性后分装-20℃保存备用。制备12% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE层积胶，以每孔总上样量为50μg依次上样电泳。切胶后200mA恒流2.5h电转移至NC膜。5%脱脂奶粉封闭1h后，分别加入兔抗PGRMC1多克隆抗体和小鼠抗β-actin单克隆抗体室温孵育1h后4℃过夜。次日用TBST洗涤后分别加入的HRP标记抗兔和抗小鼠二抗室温孵育1h，滴加ECL化学发光显色试剂，Image station 400MMPRO 柯达显像仪曝光获得图片（如图1）。所有实验均重复3次，图像分析Image-J进行图像灰度分析，以β-actin作为内参，所得的Integrated Density column（IntDen）数值为条带平均灰度和面积大小的乘积。样品PGRMC1蛋白相对表达量= PGRMC1 IntDen/β-actin IntDen。

2.2细胞培养与传代

人子宫内膜癌细胞株Ishikawa、Hec-1A、KLE用含10%FBS、105U/L青霉素、105U/L链霉素的DMEM/F-12培养基，置于在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，当细胞融合至70%～80%时按1：3比例进行传代，取状态良好的细胞进行实验。

2.3细胞免疫组化方法检测三种子宫内膜癌细胞中PGRMC1的表达 取状态良好的细胞，以合适密度接种于无菌载玻片上，放置于培养皿中继续培养，待细胞贴壁牢固后用冰丙酮固定10min，依次进行穿孔、一抗及二抗孵育、显色、脱水、封片后，在显微镜下观察并拍照。用PBS代替一抗孵育后作为阴性对照。

2.4CCK-8法检测Ag205作用后子宫内膜癌细胞活力

取状态良好的细胞，以合适密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后更换为无血清无酚红的DMEN/F-12饥饿24h，随后加入不同浓度的Ag205，每个浓度设三个复孔，继续培养72h后加入CCK-8，37℃孵育1h后用酶标仪在450nm波长处检测其吸光度（A）值，该值与细胞密度成正比，以此反应细胞活力。

2.5统计学方法

所有数据采用（±s）表示，应用SPSS20.0软件包单因素方差（ONE-WAY ANOVA）分析及LSD及SNK检验；当P<0.05时差异有统计学意义。

3结果

3.1PGRMC1在子宫内膜癌与正常内膜组织中的表达差异

本研究共纳入70例子宫内膜癌患者与28名子宫内膜癌患者，子宫内膜癌患者内膜中PGRMC1的表达较正常内膜PGRMC1的表达显著升高（P=0.038）。见表1。28例对照组内膜包括萎缩期内膜4例，增殖期内膜12例，分泌期内膜7例，单纯增生或复杂性增生3例，非典型增生2例。各型正常内膜PGRMC1的表达无差异（P=0.880）。

表1PGRMC1在子宫内膜癌内膜及正常内膜中的表达组别最大值最小值中位数PGRMC1表达量P子宫内膜癌组织（n=70）4.200.271.211.34±0.740.038正常内膜组织（n=28）1.610.240.940.99±0.35

3.2子宫内膜癌组织中 PGRMC1表达与子宫内膜癌病理分型的关系本研究中Ⅰ型癌59例，包括高分化者23例，中分化28例，低分化8例；Ⅱ型癌9例；此外还有2例为非典型增生伴癌变。各型病理类型子宫内膜癌中PGRMC1的表达水平没有统计学差异（P=0.225）。C1～C5： 子宫内膜癌N1～N2： 正常子宫内膜 Hec-1A： 人子宫内膜癌细胞系

3.3PGRMC1与子宫内膜癌分期的关系

根据2009年FIGO分期，Ⅰ期患者56例，Ⅱ期3例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。PGRMC1在各期子宫内膜癌内膜中的表达无差异（P=0.908）。在56例Ⅰ期患者中包括Ⅰa期47例，Ⅰb期9例，PGRMC1在Ⅰa期中的表达较Ⅰb期显著高（P=0.019）。见表2、表3。

3.4PGRMC1与淋巴结转移/脉管癌栓的关系

子宫内膜癌内膜中PGRMC1的表达与淋巴结转移无关（P=0.262）；与脉管癌栓无关（P=0.830）。

3.5PGRMC1表达水平与ER、PR、p53、Ki-67、bcl-2的关系

将子宫内膜癌根据不同ER、PR、p53、Ki-67、bcl-2表达状态进行分组，比较PGRMC1在各组间的表达，如表4所示，PGRMC1表达在ER高表达组明显高于ER低表达组（P=0.015），而在其余组间表达则无统计学差异。

表4PGRMC1在人子宫内膜癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性临床病理特征PGRMC1PⅠ期1.34±0.740.098Ⅱ期1.07±0.51Ⅲ期1.43±0.83Ⅳ期1.19Ⅰa期1.43±0.760.019Ⅰb期0.86±0.44ER（3.6子宫内膜癌细胞中PGRMC1的表达

三种子宫内膜癌细胞中均可见到PGRMC1阳性表达颗粒，其主要定位于胞浆中，在Hec-1A和KLE中可见细胞核周边表达相对密集，三种细胞细胞核中未见阳性表达颗粒。见图2。

3.7Ag205对子宫内膜癌细胞增殖活力的影响

在三种子宫内膜癌细胞中，随着Ag205浓度的增加，细胞活力均逐渐下降，如图3所示。在Ishikawa和Hec-1A细胞中，抑制趋势基本一致，低浓度组（5μM和10μM）Ag205与对照组相比细胞活力无明显改变，从20μM时出现显著下降；而在KLE细胞中，Ag205的抑制作用较为显著，从最低浓度5μM即出现细胞活力明显下降，并逐步增强至40μM达到最大，而且各浓度组间细胞活力均存在显著性差异。见表5。

4讨论

PGRMC1是新近受到关注的肿瘤相关小分子蛋白，其在多种肿瘤中高表达，如乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌、宫颈癌及肺癌等[1，6]，在晚期卵巢癌中，PGRMC1表达亦明显增高[7]，可能参与肿瘤的发生及进展，但具体机制还不明确。目前，子宫内膜癌中PGRMC1的表达特点及临床意义亦不清楚。本研究显示子宫内膜癌组织中PGRMC1表达增高；PGRMC1抑制剂Ag205能够明显抑制子宫内膜癌细胞活力，提示高表达的PGRMC1对于子宫内膜癌细胞的增殖具有促进作用，此增强肿瘤生长的特性有望使其成为肿瘤治疗的有效靶点。

PGRMC1基因位于Xq24，编码单次穿膜蛋白，分子量约为25KD。其N端为穿膜区，C端为细胞色素b5功能区及配体结合区，能够与含有SH2及SH3结构域的蛋白结合[8-10]。PGRMC1广泛分布于全身各组织，如肝、肾、肺、肾上腺、乳腺、子宫、卵巢、白细胞等，发挥多种功能[9， 11]。生理条件下PGRMC1通过与血红素直接结合，激活细胞色素p450酶系统，参与体内胆固醇、药物代谢，也与甾体类激素合成密切相关[5]。此外，PGRMC1能够与其他小分子蛋白共同形成孕激素受体复合物，介导体内孕激素的快速非基因组作用，调控排卵、受精及神经保护等功能[12]。

在肿瘤领域，关于PGRMC1的研究主要集中于肺癌、乳腺癌及卵巢癌，子宫内膜癌相关研究仅在细胞系中见到。因此，本研究首次对子宫内膜癌中PGRMC1蛋白表达进行了全面检测，结果显示正常内膜和内膜癌组织中均存在PGRMC1表达，但癌组织中PGRMC1表达量明显增高。Shakeel等检测了15例肺鳞癌和15例肺腺癌病人的癌及癌旁正常肺组织中PGRMC1的蛋白表达，分别有12例（80%）肺鳞癌及6例（40%）肺腺癌中PGRMC1显著增高，而且PGRMC1含量增高5倍以上的8例肺鳞癌均为低分化[13]。与肺癌不同，子宫内膜癌病灶多为弥漫性，与正常内膜界限不清，同时由于内膜癌病人以围绝经期和绝经后为主，年龄相对大，正常内膜薄，加之内膜癌病人术前多已进行了分段诊刮，正常内膜量更少，以上三方面因素造成癌旁正常内膜取材困难、准确性欠佳，因此本研究未选取癌旁内膜作为对照组，而是选取因其他疾病行子宫切除术或分段诊刮术、术后病理证实为正常或为良性病变的内膜作为对照组。本研究发现，对照内膜中增生期、分泌期及萎缩期内膜间PGRMC1表达无明显差异，提示生理条件下子宫内膜中PGRMC1表达受体内雌、孕激素水平影响较小。在牛子宫内膜中，亦未检测到PGRMC1表达随动情周期改变[14]；此外Jens等发现人外周血白细胞中PGRMC1表达也不随月经周期改变[11]，上述研究从不同角度支持本研究结果。但Chen等提出人子宫内膜中PGRMC1表达在分泌期低于增生期[15]；另一项研究在去势猕猴行人工周期的子宫内膜中，PGRMC1 mRNA和蛋白在增生期高表达，随后逐步下降，到分泌晚期降低至几乎检测不到[16]。因此，正常子宫内膜中PGRMC1的分布特点还需要进一步扩大样本量从而得到更准确的结论。

本研究显示，子宫内膜癌中PGRMC1表达与肿瘤分期、分化均无关，但在Ⅰ期内膜癌中，PGRMC1表达在Ⅰa期明显高于Ⅰb期，提示PGRMC1可能在肿瘤早期阶段发挥重要作用。PGRMC1能够被致癌剂二噁英诱导表达[17]，而且是非基因致癌物刺激后早期表达的6个蛋白之一，可能与DNA损伤耐受及凋亡抑制相关，从而在肿瘤发生早期协助肿瘤细胞得以存活。同时本研究发现内膜癌中PGRMC1与ER表达状态相关，在ER强阳性组PGRMC1表达明显增高，而Neubauer等则在乳腺癌中则发现PGRMC1在ER阴性的乳腺癌中高表达[18]，两种肿瘤中PGRMC1表达与ER表达的不一致需要深入功能研究阐述其机制，这也是未来研究的方向之一。

体外子宫内膜癌细胞免疫组化显示PGRMC1在三种人子宫内膜癌细胞中均为阳性表达，定位于细胞质中，而在细胞核中未见阳性表达。肺癌细胞A549中PGRMC1也定位于细胞质中，细胞核中阴性表达[13]。但也有报道在卵巢癌Ovcar-3和宫颈癌Hela细胞中可观察到PGRMC1在细胞核中的表达[7， 19]，PGRMC1的核转位可能参与胞浆中信号向核内的转导。

为了明确PGRMC1过表达与子宫内膜癌细胞增殖的关系，应用其小分子抑制剂Ag205干预三种子宫内膜癌细胞，结果显示Ag205能够有效抑制内膜癌细胞增殖，但在低分化内膜癌细胞KLE中抑制作用最明显。陆琳等应用SiRNA抑制PGRMC1后，Ishikawa细胞生长受到抑制，细胞凋亡增加[20]。Ahmed等通过在肺癌中的研究提出PGRMC1可能通过稳定EGFR（Epidemal Growth Factor Receptor）实现对肿瘤特性的调节[13]。因此，过表达的PGRMC1有望成为内膜癌治疗的新靶点。

综上，本研究已完成子宫内膜癌中PGRMC1分布特点分析，并观察了PGRMC1对内膜癌细胞增殖的影响，下一步将深入研究PGRMC1促进子宫内膜癌增殖的机制及对其他恶性生物学特性如侵袭、转移和化疗耐药的影响，探讨PGRMC1与雌、孕激素作用的关系，更加全面阐述PGRMC1参与子宫内膜癌发生发展的机制。

参考文献

[1]Siegel R， Naishadham D， Jemal A. Cancer statistics， 2013. CA Cancer J Clin， 2013（63）：11-30.

[2]Schneck H， Ruan X， Seeger H， et al. Membrane-receptor initiated proliferative effects of dienogest in human breast cancer cells. Gynecol Endocrinol， 2013（29）：160-163.

[3]Peluso JJ. Progesterone receptor membrane component 1 and its role in ovarian follicle growth. Front Neurosci， 2013（7）：99.

[4]Buddhikot M， Falkenstein E， Wehling M， et al. Recognition of a human sperm surface protein involved in the progesterone-initiated acrosome reaction by antisera against an endomembrane progesterone binding protein from porcine liver. Mol Cell Endocrinol， 1999（158）：187-193.

[5]Rohe HJ， Ahmed IS， Twist KE， et al. PGRMC1 （progesterone receptor membrane component 1）： a targetable protein with multiple functions in steroid signaling， P450 activation and drug binding. Pharmacol Ther， 2009（121）：14-19.

[6]Crudden G， Loesel R， Craven RJ. Overexpression of the cytochrome p450 activator hpr6 （heme-1 domain protein/human progesterone receptor） in tumors. Tumour Biol， 2005（26）：142-146.

[7]Peluso JJ， Liu X， Saunders MM， et al. Regulation of ovarian cancer cell viability and sensitivity to cisplatin by progesterone receptor membrane component-1. J Clin Endocrinol Metab， 2008（93）：1592-1599.

[8]Chen CP， Su YN， Lin HH， et al. De novo duplication of Xq22.1-->q24 with a disruption of the NXF gene cluster in a mentally retarded woman with short stature and premature ovarian failure. Taiwan J Obstet Gynecol， 2011（50）：339-344.

[9]Cahill MA. Progesterone receptor membrane component 1： an integrative review. J Steroid Biochem Mol Biol， 2007（105）：16-36.

[10]Ahmed IS， Rohe HJ， Twist KE， et al. Pgrmc1 （progesterone receptor membrane component 1） associates with epidermal growth factor receptor and regulates erlotinib sensitivity. J Biol Chem， 2010（285）：24775-24782.

[11]Schuster J， Karlsson T， Karlstrom PO， et al. Down-regulation of progesterone receptor membrane component 1 （PGRMC1） in peripheral nucleated blood cells associated with premature ovarian failure （POF） and polycystic ovary syndrome （PCOS）. Reprod Biol Endocrinol， 2010（8）：58.

[12]Thomas P. Characteristics of membrane progestin receptor alpha （mPRalpha） and progesterone membrane receptor component 1 （PGMRC1） and their roles in mediating rapid progestin actions. Front Neuroendocrinol， 2008（29）：292-312.

[13]Mir SU， Ahmed IS， Arnold S， et al. Elevated progesterone receptor membrane component 1/sigma-2 receptor levels in lung tumors and plasma from lung cancer patients. Int J Cancer， 2012（131）：E1-E9.

[14]Kowalik MK， Slonina D， Rekawiecki R， et al. Expression of progesterone receptor membrane component （PGRMC） 1 and 2， serpine mRNA binding protein 1 （SERBP1） and nuclear progesterone receptor （PGR） in the bovine endometrium during the estrous cycle and the first trimester of pregnancy. Reprod Biol， 2013（13）：15-23.

[15]Chen JI， Hannan NJ， Mak Y， et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res， 2009（8）：2032-2044.

[16]Ace CI， Okulicz WC. Microarray profiling of progesterone-regulated endometrial genes during the rhesus monkey secretory phase. Reprod Biol Endocrinol， 2004（2）：54.

[17]Selmin O， Lucier GW， Clark GC， et al. Isolation and characterization of a novel gene induced by 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rat liver. Carcinogenesis， 1996（17）：2609-2615.

[18]Neubauer H， Clare SE， Wozny W， et al. Breast cancer proteomics reveals correlation between estrogen receptor status and differential phosphorylation of PGRMC1. Breast Cancer Res， 2008（10）：R85.

[19]Bruce A， Rybak AP. CYB5D2 requires heme-binding to regulate HeLa cell growth and confer survival from chemotherapeutic agents. PLoS One， 2014（9）：e86435.

[20]陆琳， 孟伟， 郭洪波， 等. 沉默孕激素膜受体1基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的研究. 广东医学， 2010， 31（15）： 1951-1953.

[21]Wendler A， Wehling M. PGRMC2， a yet uncharacterized protein with potential as tumor suppressor， migration inhibitor， and regulator of cytochrome P450 enzyme activity. Steroids， 2013（78）：555-558.