戴金华 廖于峰 冷江涌 马建波 李克强

【摘要】目的：分析前列腺癌患者血清miR-146a与miR-152的表达水平及临床意义。 方法：以2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科诊治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及健康体检志愿者各46例为研究对象，分析各组患者血清miR-146a与miR-152的表达水平及与临床病理参数之间的关系。结果：miR-146a在前列腺癌患者血清中的表达水平显著高于良性前列腺增生及正常组血清，且前列腺良性增生组血清中miR-146a的表达量亦较正常组高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；miR-152在前列腺癌患者较良性前列腺增生及正常组血清显著偏低（P<0.05），但在良性前列腺增生和正常组之间无统计学差异（P>0.05）；血清miR-146a在不同病理分期、临床分期、有无骨转移及血清tPSA有关（P<0.05），与年龄无关（P>0.05）；而miR-152与不同病理分期、临床分期、有无骨转移有关（P<0.05），与血清tPSA水平无相关性（P>0.05），与年龄无显著相关性（P>0.05）。 结论：miR-146a与miR-152在前列腺癌患者血清中的表达水平发生了显著改变，为用于前列腺癌的早期诊断及病程的判断提供了相关实验依据。

【关键词】前列腺癌；血清；miR-146a；miR-152

Serum miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients and their clinical significanceDAI Jinhua1， LIAO Yufeng1△， LENG Jiangyong2， MA Jianbo1， LI Keqiang2. 1.Department of Clinical Laboratory， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， Zhejiang， China； 2.Urology Department，Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， Zhejiang， China

【Abstract】Objectives： To analyze serum circulating miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients and their clinical significance. Methods： Prostate cancer， benign prostatic hyperplasia patients and healthy volunteers from July 2012 to April 2013 in our hospital were recruited for the study， 46 cases in each group. The serum miR-146a， miR-152 expression levels and correlativity with clinic pathological parameters were analyzed. Results： The miR-146a expression levels in the serum of prostate cancer group was significantly higher than these in benign prostatic hyperplasia group and normal group， and miR-146a expression levels in the serum of benign prostatic hyperplasia group was higher than normal group， with statistically significant difference （P< 0.05）； miR-152 in prostate cancer group was decreased significantly compared with benign prostatic hyperplasia group and normal group （P<0.05）， but no significant difference was found between benign prostatic hyperplasia and normal group （P> 0.05 ） ； serum miR-146a was related with different pathological stage， clinical stage， with or without bone metastases （P<0.05）. Serum miR-146a had no relationship with serum tPSA （p>0.05）； whereas miR-152 was related with various pathologic stage， clinical stage， with or without bone metastasis （P<0.05）， but serum tPSA levels had no correlation with miR-152 （P> 0.05）. Conclusion： Serum miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients have significant changes， which provides relevant experimental basis for the early diagnosis of prostate cancer and determine the course.

【Key words】Prostate cancer； Serum； MiR-146a； MiR-152

【中图分类号】R697+.3【文献标志码】A

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一，发病率随着年龄的增长而升高，且呈现出地区差异性。我国前列腺癌的发病率虽较欧美地区低，但随着人口老龄化进程的加快和饮食结构的改变，其发病率逐年上升，呈现出恶性程度高、预后差等特点[1]。微小RNA（MicroRNA）是一类高度保守内源性非编码的小核苷酸序列，近年MicroRNA所介导的基因转录后调控的研究成果为前列腺癌发病机制及早期诊断的研究开辟了新的思路[2]。研究显示miR-146a在早期前列腺癌中表达有所升高，可能参与前列腺癌的发生发展过程[3]。针对miR-152的研究表明其在前列腺癌等多种肿瘤组织中表达下调，作为一种肿瘤抑制因子，通过调节转化生长因子-α（TGF-α）的表达，影响前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力[4]。本研究采用RT-PCR检测前列腺癌、前列腺良性增生及正常患者血清中miR-146a及miR-152的表达水平，为前列腺癌的早期诊断提供实验依据。

1资料与方法

1.1临床资料

以2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科诊治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及健康体检志愿者中采用随机数表法各选择46名作为研究对象，年龄（67.6±8.2）岁，所有前列腺癌及良性前列腺增生患者经穿刺活检病理学确诊且抽血前未经任何治疗；排除患有高血压、急性感染、结核病及糖尿病等疾病的患者。前列腺癌的病理分级依据2003年WHO前列腺癌病理组织学分类标准的Gleason评分，肿瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期标准（即ABCD分期）。所有患者及家属签署知情同意书，并通过了医院伦理委员会的审批。

1.2主要仪器与试剂

Trizol、RNAisoTMPlus及RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；Taq man MicroRNA Assay 及miRVana TMmiRNA Isolation Kit购自美国Ambion公司；miR-146a、miR-152及U6引物由吉凯基因（上海）提供；DU-730购自美国 BECKMAN 公司；双稳定时电泳仪DYY-6C购自北京六一公司；ABI PRISM7300 RT-PCR仪购自美国ABI公司。

1.3RT-PCR检测血清miR-146a、miR-152的表达

1.3.1血清样本制备 抽取参与对象外周血3mL于真空采血管，室温静置1h后，4℃，3000r/min离心15min，收集上清，保存于-80℃冰箱备用。

1.3.2血清总RNA抽提 采用Trizol法提取血清总RNA，加无水乙醇洗涤后，再加10～50μL DEPC水溶解，核酸纯度分析仪分析RNA纯度，A260/A280在1.8～2.0之间，DU-730计算RNA浓度，分装保存于-80℃备用。

1.3.3RT-PCR检测血清miR-146a、miR-152的表达 分别检测参与对象的血清miR-146a、miR-152的表达水平。

逆转录：取 100ng Total RNA、1μL M-MLV（购自 TAKARA 公司）、1μL（1μM/μL）miRNA 反转录引物，总体系为20μL，反转录合成 cDNA。先将模板，引物与H2O 混匀后 65℃变性 5min 后置冰上，再加入酶、PCR Buffer 等试剂，逆转录参数为 16℃ 30min，37℃ 30min，70℃ 10min，4℃保存。完成后将样本-80℃保存备用。

扩增：10μLMaster Mix、6.4μL ddH2O、10μM PCR引物、1μL RT产物，共20μL。PCR反应条件：94℃，5min；94℃，30min；59℃，30s；30个循环，最后72℃，8min。每例样本3重复，ABI7300记录Ct值，以U6为内参，以N=2-ΔCt计算相对表达量。

1.4统计学分析

应用SPSS19.0统计软件对统计资料进行分析。计量资料用（±s）表示，两独立样本两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用F检验。血清中miR-146a、miR-152的表达水平与各临床病例参数间的关系采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血清miR-146a、miR-152的表达水平分析

对各组患者血清中miR-146a、miR-152的表达水平进行比较。结果显示，miR-146a在前列腺癌患者血清中的表达水平较良性前列腺增生及正常组血清显著升高，且前列腺良性增生组血清中的表达量亦较正常组高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见图1A。miR-152在前列腺癌患者较良性前列腺增生及正常组血清显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），但在良性前列腺增生和正常组之间无统计学差异（P>0.05）。见图1B。

2.2血清miR-146a、miR-152的表达与临床病理参数的相关性分析单因素方差分析和t检验结果显示，血清miR-146a在不同病理分期、临床分期、有无骨转移及血清tPSA有关（P<0.05），在≤60与>60岁组无统计学差异（t=0.48，P<0.05）；而miR-152与不同病理分期、临床分期、有无骨转移有关（P<0.05），与血清tPSA水平及年龄分无显著相关性（P>0.05）。见表1。

3讨论

前列腺癌是发生于前列腺腺体的恶性肿瘤，在老年男性人群中并发率高，严重威胁患者的生命健康，给家庭和社会带来了沉重的压力[5]。随着研究者对前列腺癌发病机制研究的深入，前列腺癌的诊断方法不断改进，如酸性磷酸酶的测定、前列腺特异性抗原筛查等为前列腺的早期诊断、早期治疗提供了可靠的方法[6，7]。

MicroRNA作为宿主基因在细胞核内转录前体转录本，在细胞质内通过招募相关蛋白组成沉默复合体RISC与靶microRNA互补结合，降解或抑制mRNA，在转录后水平调节靶基因的表达[8]。miR-146a是一个与免疫相关miRNA，虽然miR-146a在肿瘤、炎症中的作用机制尚未完全清楚，但与细胞因子存在着密切的联系，研究发现其能够通过负调控NF-kB通路抑制IL-6、IL-1β及TNF-α等细胞因子的表达[9，10]，还能够抑制胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。已有研究报道显示转染miR-146a的PC3细胞形成克隆的大小和数目都要显著较对照组低，提示miR-146a能够抑制PC3的体外克隆能力[11]。本研究显示在前列腺癌患者血清中miR-146a的表达水平要显著高于良性前列腺病变及健康对照组患者，提示miR-146a可能参与前列腺癌的发生发展过程，为前列腺癌的早期诊断提供相关实验依据。多项研究表明miR-152在卵巢癌、结肠癌等多种实体肿瘤中的表达下调[12，13]；研究显示miRNA-152能够通过调理MMP-3及NRP-2的表达抑制神经胶质瘤细胞的侵袭及血管生成[14]，子宫内膜癌中miRNA-152的水平上调能够显著抑制肿瘤的生长[15]，但对于前列腺癌的报道较少。本研究结果显示在前列腺癌患者血清中miR-152的表达水平显著降低，miR-152与不同病理分期、临床分期、有无骨转移有关（P<0.05），与血清tPSA水平无显著相关性（P>0.05），随着病情的加重miR-152的表达水平显著降低。表明miRNA-152的血清表达水平与前列腺癌的病理分期存在一定的相关性，提示血清miRNA-152可以作为预测前列腺癌进展的生物标志物。

综上所述，miR-146a与miR-152在前列腺癌患者血清中的表达水平发生了显著改变，提示其可能在前列腺癌的发生发展过程中有重要的作用，为前列腺癌的早期诊断及病程的判断提供了相关实验依据。

参考文献

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