急性饮酒对小鼠海马CA1区锋电位的影响*

2016-11-09俞荷娟张雅檬张言钱志余陶玲李韪韬

生物医学工程研究 2016年3期

俞荷娟，张雅檬，张言，钱志余，陶玲，李韪韬

（南京航空航天大学自动化学院，南京210006）

1 引言

酒精（乙醇）是一种亲神经的麻醉剂，慢性酗酒和暴饮性饮酒均可引起脑损伤，过去几十年有关酒精导致脑损伤的研究[1-3]多集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精滥用和酒精依赖等。Oscar等认为[4-5]酒精在细胞水平上以各种方式直接影响神经系统尤其是大脑的功能，一次大量饮酒导致急性酒精中毒导致的急性脑损伤具有独特的生物化学和中枢神经系统变化[6-7]。海马是人类与哺乳动物大脑都存在的重要脑区，长期研究结果表明，海马脑区与学习、记忆、空间定位等功能密切相关。研究发现，一次性大量饮酒可以导致小鼠大脑氧自由基相关生物学标志物水平的变化，表现为降低降解自由基酶的活力和升高氧自由基的水平，从而可能造成脑损伤[8-9]。

锋电位（Spike）是细胞外记录到的神经元单细胞动作电位。神经元是神经活动的最基本单位，且大多数神经元之间通过锋电位的发放进行信息的交流和传递[10]。神经系统中，由于动作电位（即锋电位）的发放有或无、传输无衰减的数字信号特性，神经元通过对锋电位进行编码来表征信息，如发放速率，发放间隔等。在脑功能（知觉，运动）方面，锋电位的发放模式与行为密切相关。此外，锋电位的发放紊乱也会导致脑部的一些疾病（癫痫，抑郁症等）。因此，研究神经元的锋电位发放是研究神经系统信息处理机制的关键。

随着人们对大脑的认识越来越深入，各种研究方式和手段也在不断的进步。其中电生理技术的应用，便为许多脑神经活动的研究提供了重要的依据。为了获取信息在神经元网络中的时间空间响应模式，必须要使用高分辨率的检测技术。胞外记录是目前从活体动物的神经组织中获得这种精确信息的最好工具[11]。通过置于神经元细胞体附近的电极，可以获得时间分辨率为毫秒精度的动作电位发放信息，具有高时间空间分辨率的特点。此外，通过植入大量电极，在不对组织造成很大伤害的情况下，还能够获得一定空间范围内数百个神经元的活动变化规律。

本研究通过在麻醉状态下的小鼠海马CA1区植入记录电极，稳定采集并记录到较长时间、较为稳定的微幅级锋电位信号，并使用神经电信号分析软件对急性饮酒前和急性饮酒后的锋电位进行了放电频率、锋电位发放时间间隔等多项指标的分析。本研究观察小鼠急性饮酒前及急性饮酒后神经元在放电频率、峰间期（ISI）等方面的变化，描述并分析此变化过程中小鼠海马区神经电信号的特征差异。

2 材料与方法

2.1 材料

（1）实验动物：16只ICR小鼠，体质量25～35 g，清洁级，购自南京市江宁区青龙山动物养殖场。

（2）实验仪器与试剂：微电极；多通道神经信号采集系统（Cerebus，Blackrock公司），包括前置放大器（headstage）、Front-end放大器模块、信号处理器及操作计算机，计算机与信号处理器间通过网络相互通讯；脑立体定位仪（ZH-蓝星B，淮北正华生物仪器设备有限公司）；5%水合氯醛。

2.2 实验方法

（1）动物手术：利用ICR小鼠16只，随机分成2组（n＝8）：急性饮酒组（P组）和生理盐水组（C组）。将小鼠称重，按45 mg／（100 g体重）计量腹腔注射复合麻醉剂，待完全麻醉后卧姿固定四肢及头部在小鼠脑立体定位仪上，切开头部皮肤，除去部分颅骨。将记录电极经大脑皮层插入海马CA1区，定位是前囟后1.8 mm，旁开1.5 mm，由大脑皮层表面向下约2 mm，放好参考电极和接地电极。上下微调记录电极的位置，直到记录到明显的锋电位信号为止。

（2）小鼠海马区锋电位（Spike）的采集记录：设置信号采集处理系统Cerebus的各项参数[12]：以采样率为30 Khz进行原始数据采集，调整采样率为2 Khz得到LFPs；再选择250～7 500 Hz带通滤波，设定阈值为-5.00 RMS增益，选取信噪比超过1.5的锋电位认定为每个细胞外神经点位，即为锋电位Spikes。边观察采样窗口扫描波形，边适当调整记录电极尖端深度，直至采样记录窗口出现的放电波形大于阈电位、利用采样记录软件可选择的色标，将多种记录波形以不同颜色加以区分，同时在记录窗口的各子窗口将不同的叠加波形分别显示。实时观察采样电信号的信噪比（signal noise ratio，SNR）大小，当SNR值大于1.5且较稳定后采集记录神经放电信号。以时间长度每300 s为一采集记录单位，按照系统设定的存储文件格式存档以作进一步离线分析。采用趾的刺激反射（趾蹼反射）和角膜反射判断大鼠麻醉及复苏状态，然后分别在小鼠复苏后急性饮酒前以及急性饮酒后 0、20、40、60、80 min记录小鼠海马区神经电信号，每次实验记录5 min，其中急性饮酒量为1.5 g／（kg体重）。

（3）神经电信号分析：采用信号分析处理软件wave clus和NeuroExplorer分析存储的放电信号文件，比较急性饮酒前和急性饮酒后 0、20、40、60、80 min小鼠海马CA1区神经元锋电位在放电频率、ISI等方面的差异。

3 统计学处理

实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行常规统计，比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

图1 （a）电极在海马区中的植入位置（b）电极插入照片Fig 1 （a）position of the electrodes implanted in the hippocam pus（b）picture of inserted electrode

4.1 电极摆放的解剖学位置

海马CA1区定位是前囟后1.8 mm，旁开1.5 mm，由大脑皮层表面向下约2 mm。图1（a）是电极在海马区中的植入位置，图1（b）是实验中电极插入小鼠海马区照片。

4.2 8通道的原始信号

图2是记录到的海马区神经元锋电位发放光栅图，图中每条短线代表一次锋电位发放。

图2 海马区神经元锋电位发放原始信号光栅图A、B、C、D、E、F分别代表饮酒前、饮酒后0、20、40、60、80 min。Fig 2 Raster p lots of spikes distributed by hippocam pal neuronsA，B，C，D，E，F，respectively，on behalf of the time before drinking，0，20，40，60，80min after drinking

4.3 小鼠苏醒时及急性饮酒后神经元自发放电信号特征差异比较

运用神经信号分析软件Neuro Explorer分析发现，P组与C组比较，在每个时间段，P组平均放电率小于C组平均放电率（P组平均放电率依次为：1±0.32、0.48±0.14、0.13±0.09、0.54±0.17、0.82±0.26、0.93±0.29，C组平均放电率依次为：1±0.3、0.81±0.21、0.86±0.18、0.91±0.15、0.94±0.23、0.96±0.21）；P组小鼠在急性酒精注射后，海马CA1区神经元自发放电减小，20 min左右放电率最低，并且急性饮酒后平均放电率远小于急性饮酒前（清醒状态）；并且随着时间的推移，神经元在单位时间内放电在逐渐增加（复苏状态），1 h后慢慢恢复，即小鼠急性饮酒前后神经元放电频率存在明显差异（见图3），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 锋电位平均放电率曲线图Fig 3 M ean firing rate of spikes

急性饮酒前，神经元电信号以串的形式呈有节律的阵发性发放（图4A，图4为一只老鼠的ISI变化图）。随着饮酒后时间的增加，小鼠海马CA1区自发放电有越来越多的脉冲出现在串脉冲之外，渐呈弥散性发放（图4B、4C），全时长的自发放电频率均小于饮酒前状态。急性饮酒前的小鼠ISI值较为集中（清醒状态）（图4A），急性饮酒后的小鼠ISI值较为分散（图4B、4C、4D），并随着时间的推移，ISI值逐渐变得集中（复苏状态，见图4E、4F）。

图4 急性饮酒前后ISI变化图A、B、C、D、E、F分别代表饮酒前、饮酒后0、20、40、60、80 minFig 4 Changes of ISI before and after acute alcohol consumptionA，B，C，D，E，F were on behalf of the time before drinking and 0，20，40，60，80 min after drinking

5 讨论

有关酒精导致脑损伤的研究很多都集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精滥用和酒精依赖等。而有关酒精导致脑损伤在急性饮酒方面的研究大都集中在生理层面[13]，比如进行离体脑片和急性饮酒对鼠脑损伤标志物的影响等。本研究着力于从电生理角度在体测量小鼠脑电信号，研究急性饮酒前后小鼠海马CA1区神经元放电特征差异。

本研究的前期工作已稳定地采集记录到小鼠急性饮酒前后、海马CA1区神经元的放电信号，并对测得的信号进行了放电频率等指标的分析。为了探索急性饮酒前后小鼠海马区神经元自发放电特征是否存在差异，本实验采用单次大量酒精腹腔注射作为急性饮酒的动物模型，并进行实验数据的分析。选用该动物模型除了操作简单易行以外，单次大量酒精腹腔注射更与现实人们偶尔饮酒过量这种情况相似[14]。大多数人认为偶尔急性饮酒可能对身体一般机能有些影响，但不会对记忆造成大的影响。这正是本研究要强调的即使是一次急性饮酒也会对大脑记忆能力产生损害[15]。

本研究表明，急性腹腔注射酒精后的小鼠海马CA1区神经元自发放电减少，20 min左右放电率最低，远小于急性饮酒前；并且随着时间的推移，神经元放电在逐渐增加，一个小时之后慢慢恢复。急性饮酒后，神经元电信号以串的形式呈有节律的阵发性发放；随着饮酒后时间的增加，小鼠海马CA1区自发放电有越来越多的脉冲出现在串脉冲之外，渐呈弥散性发放，全时长的自发放电频率均小于饮酒前状态。此外，急性饮酒前的小鼠ISI值较为集中，急性饮酒后的小鼠ISI值较为分散，并随着时间的推移，ISI值逐渐变得集中。这一结果与文献报道进行的行为实验结果一致[16]。

从生理机制来看，酒精可以快速通过血液屏障进入脑组织中进行氧化和非氧化代谢因为大脑有很高的氧代谢率，其对于由酒精引起的氧化应激损伤更为敏感。根据对小鼠急性饮酒对小鼠脑损伤生物标志物的影响，一次性大量饮酒就会诱发脑组织的氧化应激性损伤[8，17-18]，这与本研究实验结果一致。本研究利用神经信号分析软件对电信号进行分析发现急性饮酒前后小鼠海马区神经元自发放电频率方面存在差异，急性饮酒对小鼠记忆功能有着抑制作用，为急性饮酒所致的记忆力损伤的预防和治疗提供了有意义的神经电生理依据。