胥军，丛支亮，郭亮，牛学才，闫召华

(1济南市槐荫人民医院，济南 250021；2济南市第四人民医院)



乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表达与多西紫杉醇化疗效果的关系

胥军1，丛支亮2，郭亮2，牛学才2，闫召华2

(1济南市槐荫人民医院，济南 250021；2济南市第四人民医院)

目的观察乳腺癌患者外周血谷胱甘肽转硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽转硫酶T1(GSTT1)基因表达与多西紫杉醇化疗效果的关系。方法乳腺癌患者300例，均采用多西紫杉醇化疗，Multiplex-PCR检测患者化疗前外周血GSTM1、GSTT1基因，观察GSTM1、GSTT1基因阳性与乳腺癌临床病理参数的关系、患者化疗效果及不良反应。结果300例乳腺癌患者GSTM1基因阳性126例，GSTT1基因阳性222例。雌激素受体阳性乳腺癌患者GSTM1基因阳性率较雌激素受体阴性低(P<0.01)，雌激素受体阳性乳腺癌患者GSTT1基因阳性率较雌激素受体阴性低(P<0.05)。GSTM1基因阳性、阴性患者CR+PR分别为50、99例，两者比较，P<0.05。GSTT1基因阳性、阴性患者CR+PR分别为93、56例，两者比较，P<0.05。GSTM1基因阳性、阴性患者发生化疗不良反应情况比较差异无统计学意义，GSTT1基因阳性、阴性患者发生化疗不良反应情况比较差异无统计学意义。结论乳腺癌GSTM1和GSTT1基因表达阴性者接受多西紫杉醇化疗效果好，且不增加不良反应的发生。

乳腺癌；谷胱甘肽转硫酶M1；谷胱甘肽转硫酶T1；多西紫杉醇

研究表明，谷胱甘肽转硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽转硫酶T1(GSTT1)基因具有多态性，与药物代谢酶的活力改变有关。多西紫杉醇是广谱抗肿瘤药物，对乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、白血病均有效，其中治疗乳腺癌、肺癌效果显著[1]。多西紫杉醇抗肿瘤的疗效已经得到多项大规模临床试验的证实,但不同患者对多西紫杉醇的应答差异很大，在接受多西紫杉醇治疗的患者中约有10%会发生过敏反应，主要包括中性粒细胞减少、血红蛋白减少、恶心呕吐、疲劳、体液潴留等[2,3]。多西紫杉醇药物作用过程涉及药物代谢、转运及作用靶点基因，其中一些遗传多态性位点的单独作用可能是微弱的，而很多位点的联合与累积作用会导致药物效应产生较大差异[4]。不同个体对药物的敏感性和不良反应存在明显差异，为减少临床治疗的盲目性，实行个体化给药，开展多西紫杉醇药物基因组学研究及其应用非常必要[5]。本研究观察了乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表达与多西紫杉醇化疗效果的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2013年1月～2015年8月在济南市第四人民医院住院的乳腺癌患者300例。纳入标准：术后经病理形态学和免疫组织化学确诊；采用多西紫杉醇化疗；化疗前美国东岸癌症临床研究合作组织(ECOG)评分0～2分；预计生存期>3个月；符合化疗的指征和基本要求；知情同意。排除不能耐受化疗者，已进行化疗者，合并其他恶性肿瘤者。年龄40～67(56.9±13.8)岁；淋巴结转移212例；TNM分期Ⅰ期62例、Ⅱ期70例、Ⅲ期36例、Ⅳ期132例；浸润性导管癌238例，浸润性小叶癌52例，其他10例。

1.2主要仪器及试剂紫外分光光度计(N2S，上海仪电分析仪器有限公司)；超净工作台(AIRTECH，苏净集团安泰公司)；台式低温高速冷冻离心机(3K3,Sigma,美国)；实时荧光定量PCR系统(ABI step one plus，美国)；普通酶标仪(DG-3022，美国)；杂交Chamberll(Coming，美国);凝胶成像仪(CapitalBio；中国)；GeneChip®Scanner (Affymetrix，美国)。DNA Blood Kit D3392-01(美国OMEGA公司)；DNA Marker DM500(康为世纪生物科技有限公司)；5×TBE Buffer(康为世纪生物科技有限公司)；其他试剂均为本地产分析纯试剂。

1.3GSTM1、GSTT1基因检测方法化疗前采取外周血5 mL于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存备用。取250 μL解冻标本至经高温消毒灭菌的1.5 mL离心管，加入250 μL的OB蛋白酶和25 μL的BufferBL，充分混匀。65 ℃水浴，每隔5 min充分混匀1次。加入260 μL无水乙醇，混匀，转移至套在2 mL收集管的Hibind DNA柱子中，室温离心(10 000 r/min×2 min)。将收集管转移至干净的收集管中，加入500 μL的HB Buffer，室温离心(10 000 r/min×2 min)，弃去滤液。加入700 μL的DNA wash buffer，室温离心(10 000 r/min×2 min)，弃去滤液，重复进行两次。于1.5 mL离心管上，加入50 μL 65 ℃预热的Elution buffer到柱子中央基质上。静置5 min，室温离心(10 000 r/min×2 min)，保留洗脱液。采用微量分光光度仪进行DNA质量鉴定。采用Multiplex-PCR检测GSTM1和GSTT1基因。GSTM1和GSTT1基因PCR引物由上海西宝生物有限公司合成。GSTM1引物序列：上游5′-GAACTCCCTGAAA-AGCTAAAGC-3′，下游5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′。GSTT1引物序列：上游5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3′，下游5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′。以β-globin作为内参，其引物序列：上游5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，下游5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′。反应条件：95 ℃ 5 min起始模板预变性，循环1次；95 ℃ 45 s循环中模板变性；60 ℃ 20 s退火；72 ℃ 45 min延伸。反应共循环45次。结果判断：GSTM1和GSTT1非缺失基因型者的DNA样品经PCR扩增后分别产生215、480 bp片段，缺失基因型者无相应的扩增条带。

1.4多西紫杉醇化疗疗效及不良反应判断化疗2个疗程后，参照实体瘤疗效评价标准评定疗效：所有目标病灶消失，维持4周为CR；基线病灶长径总和缩小≥30%，维持4周为PR；基线病灶长径总和增加≥20%或出现新病灶为PD；基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD为SD。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

300例乳腺癌患者GSTM1基因阳性126例，GSTT1基因阳性222例。雌激素受体阳性乳腺癌患者GSTM1基因阳性率较雌激素受体阴性低(P<0.01)，雌激素受体阳性乳腺癌患者GSTT1基因阳性率较雌激素受体阴性低(P<0.05)，见表1。GSTM1基因阳性、阴性患者CR+PR分别为50、99例，两者比较，P<0.05。GSTT1基因阳性、阴性患者CR+PR分别为93、56例，两者比较，P<0.05。GSTM1基因阳性、阴性患者发生化疗不良反应情况比较差异无统计学意义，GSTT1基因阳性、阴性患者发生化疗不良反应情况比较差异无统计学意义，见表2。

3　讨论

乳腺癌为女性常见恶性肿瘤，其患病率在世界范围内逐年增高，且具有发病率年轻化的趋势，是严重威胁妇女健康及生命的主要疾病之一[6]。随着医疗技术的不断发展，乳腺癌患者的预后不断改善，生存率不断提高。多西紫杉醇是一种对乳腺癌很有效的新型化疗药物，已广泛用于局部晚期以及复发转移性乳腺癌的治疗，显著改善了乳腺癌患者的预后。既往研究发现了一些多西紫杉醇药效相关基因标记，但多数局限于一个或者少数相关基因，而多西紫杉醇在体内的作用过程涉及到多基因及多因素。

谷胱甘肽转硫酶(GST)是一种重要的Ⅱ相解毒酶，它可催化外来化合物与还原型谷胱甘肽结合，形成的结合物毒性下降且易于排出体外。因此，在保护细胞免受化学有害物的攻击方面具有重要的作用[7]。GSTM1和GSTT1是GST家族成员，两者均对外源性化学物质有解毒的功能，而两者的纯合子缺失变异基因型被证实失去酶活性[8]。GSTM1基因长约12 950 kb，位于1p13.3，编码中性的GST-u同工酶，在乳腺、肝脏、脑组织、胃肠组织中均有表达，是烟草诱导致癌作用的遗传易感性标志物。GSTT1基因长约12 090 kb，位于22q11.2，编码碱性的GST-θ同工酶，在肝脏和红细胞中均有表达[9]。GSTM1和GSTT1基因表达产物可防御内外源性毒性物质对细胞的损伤[10]。本研究结果表明，乳腺癌患者GSTM1和GSTT1基因表达与雌激素受体表达有关，GSTT1、GSTM1基因缺失可能降低了雌激素无活性代谢进程。乳腺癌是激素依赖性肿瘤，雌激素的代谢产物可与DNA结合形成加合物直接引起基因改变，导致肿瘤的发生[11]。可见，GSTT1、GSTM1基因缺失可能在乳腺癌的发生发展过程中具有重要作用。本研究发现，GSTM1基因阴性患者疗效高于GSTM1阳性患者，GSTT1基因阴性患者疗效高于GSTT1阳性患者，推测原因为GSTM1、GSTT1基因缺失导致GST-u同工酶和GST-θ同工酶不能表达，使多西紫杉醇的有效浓度提高。且本研究发现GSTM1和GSTT1基因与多西紫杉醇化疗不良反应均无关。

表1　　　　GSTM1、GSTT1基因阳性与乳腺癌临床病理参数的关系(例)

表2　　　　GSTM1、GSTT1基因与多西紫杉醇化疗不良反应的关系(例)

综上所述，乳腺癌GSTM1和GSTT1基因表达阴性者接受多西紫杉醇化疗效果好，且不增加不良反应的发生。

[1] 王健，唐金海，赵建华.紫杉醇相关代谢酶和药物转运体基因多态性与乳腺癌化疗反应[J].分子诊断与治疗杂志，2010，2(1)：63-67.

[2] Yang J, Zeng Y, Zhang C, et al. The prevention of restenosis in vivo with a VEGF gene and paclitaxel co-eluting stent[J]. Biomaterials, 2013,34(6):1635-1643.

[3] 董宁宁，周艳华，吴咏冬.乳腺癌化疗的药理遗传学研究进展[J].现代肿瘤医学，2015，23(3)：427-430.

[4] Nam K, Nam HY, Kim PH, et al. Paclitaxel-conjugated PEG and arginine-grafted bioreducible poly (disulfide amine) micelles for co-delivery of drug and gene[J]. Biomaterials, 2012,33(32):8122-8130.

[5] Schneider BP, Gray RJ, Radovich M, et al. Prognostic and predictive value of tumor vascular endothelial growth factor gene amplification in metastatic breast cancer treated with paclitaxel with and without bevacizumab; results from ECOG 2100 trial[J]. Clin Cancer Res, 2013,19(5):1281-1289.

[6] 孙献甫，刘慧，贺亚宁，等.扶正消癌方治疗乳腺癌术后内分泌综合征50例[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(2)：192-195

[7] Peatson WR, Verachek WR, Xu SJ, et al. Identficiation of class mugultathoine S-transferase genes GSTM1-GSTM5 on human chromosome lp13[J]. Am J Hum Ganet, 1993,53(1):220-233.

[8] Strange RC, Jones PW, Fryer AA. Glutathione S-transferase: Genetics and role in toxicology[J]. Toxicol Lett, 2000,112-113:357-363.

[9] Li C, Long J, Hu X, et al. GSTM1 and GSTT1 genetic polymorphisms and risk of anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity: an updated meta-analysis[J]. Euro J Clin Microbiol Infect Dis, 2013,32(7):859-868.

[10] Sharma A, Das BC, Sehgal A, et al. GSTM1 and GSTT1 polymorphism and susceptibility to esophageal cancer in high-and low-risk regions of India[J]. Tumour Biol, 2013,34(5):3249-3257.

[11] Ada AO, Kunak SC, Hancer F, et al. Association between GSTM1, GSTT1, and GSTP1 polymorphisms and lung cancer risk in a Turkish population[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(5):5985-5993.

济南市科技计划项目(201401072)。

闫召华(E-mail： Yanzhaohua70@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.031

R737.9

B

1002-266X(2016)23-0090-03

2015-12-03)