王昕，王鹏，李玲，潘雪，余祖江，蒋莉莉

(1 郑州大学护理学院基础教研室，郑州 450052；2郑州市第九人民医院；3郑州大学第一附属医院)



US3基因转染树突状细胞诱导的T淋巴细胞增殖活性及NK细胞杀伤活性观察

王昕1，王鹏1，李玲2，潘雪1，余祖江3，蒋莉莉1

(1 郑州大学护理学院基础教研室，郑州 450052；2郑州市第九人民医院；3郑州大学第一附属医院)

目的观察US3基因转染树突状细胞(DCs)诱导的T淋巴细胞增殖活性和自然杀伤(NK)细胞杀伤活性。方法构建表达US3基因腺病毒载体r-US3和空载体r-Track。分离培养DCs，分为r-US3组(转染r-US3的DCs细胞)、r-Track组(转染r-Track的DCs细胞)和正常对照组，将三组细胞分别与T淋巴细胞混合培养，MTT法观察各组DCs诱导的T淋巴细胞增殖活性；另外将三组细胞分别与NK细胞混合培养，乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞杀伤活性。结果r-US3组、r-Track组、正常对照组混合培养第24 h时T淋巴细胞增殖活性分别为1.250 0±0.062 4、1.653 3±0.035 1、1.596 7±0.066 6，混合培养第48 h时分别为1.823 3±0.066 6、2.203 3±0.047 3、2.136 7±0.060 3，r-US3组与r-Track组、正常对照组相比，P均<0.05。r-US3组、r-Track组、正常对照组NK细胞杀伤DCs活性分别为87.67%±3.21%、103.02%±2.65%、100.00%，r-US3组与r-Track组、正常对照组相比，P均<0.05。结论转染US3基因的DCs诱导的T淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤活性降低。

树突状细胞；T淋巴细胞；自然杀伤细胞;US3基因；免疫逃逸

腺病毒载体被广泛地应用于基因治疗的各个领域[1,2]。但腺病毒载体表达的载体结构蛋白和外源治疗基因表达的蛋白产物均会诱导宿主产生细胞和体液免疫反应，引起局部组织的炎症和破坏，迅速被机体清除，导致目的基因的表达效率降低、表达时间缩短[3]。而传统的免疫抑制剂几乎都能抑制人体的免疫系统，增加患者感染和发生肿瘤的危险性。基因治疗的研究越来越重视诱导特异性免疫耐受，而不再过分地关注有效的免疫抑制剂，减少或消除机体对腺病毒载体蛋白的免疫排斥反应成为基因治疗中的研究热点。有研究[4,5]报道，将病毒本身所具有的免疫调控基因片段构建于腺病毒载体，可介导免疫逃逸，特异性地阻断机体针对腺病毒载体的免疫反应。近年研究[6]发现，人类巨细胞病毒(HCMV)编码的免疫调控基因片段US3基因与病毒的免疫逃逸活性关系密切。本研究构建表达US3基因的腺病毒载体，转染树突状细胞(DCs)，通过T淋巴细胞增殖实验和自然杀伤(NK)细胞杀伤实验，观察US3基因转染对DCs诱导的T淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤活性的影响。

1　材料与方法

1.1细胞株及试剂293T细胞株购自中国科学院细胞库。琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自英国Oxoid公司。DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自New England Biolab公司，高保真Pfu DNA Polymerase酶购自美国Promega公司。质粒提取试剂盒、PCR清洁试剂盒、胶回收试剂盒购自北京TransGen公司。其余试剂购自Sigma公司。

1.2重组腺病毒r-US3的构建将HCMV型阳性标本(郑州大学第一附属医院检验科提供)进行病毒DNA提取，PCR扩增U3基因。引物：sense为5′-CCGAAGCTTATGAAGCCGGTGTTGGTGCTCGC-3′，a-ntisense为5′-GCCGATATCAATAAATCGCAGACGG-GCGCTCAC-3′，上游引物含有Hind Ⅲ酶切位点，下游引物含有EcoR Ⅴ。依照说明书要求，依次加入模板HCMV、上下游引物、Pfu DNA Polymerase、dNTPs、10×PCR Buffer及适量的ddH2O，建立50 μL PCR反应体系，95 ℃预变性2 min后，95 ℃、30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环，循环结束后72 ℃延伸5 min。PCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，测序。测序正确的序列通过PCR扩增US3-His-tag融合基因。引物：sense为5′-CCGAAGCTTATGAAGCCGGTGTTGGTGCTCGC-3′，antisense为5′-GCCGATATCTTAATGATGATGATGAT-GATGAAT-3′。PCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，测序鉴定。将扩增好的US3-His-tag融合基因片段和腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接，构建pAdTrack-US3。PmeⅠ酶切后共转化含pAdEasy-1质粒的感受态BJ5183细菌，构建重组腺病毒载体pAdEasy-US3。PacⅠ单酶切后，采用脂质体转染法在293T细胞中进行包装，构建重组腺病毒r-US3，并进行CsCl梯度纯化和滴度测定。同样的方法构建空载重组腺病毒r-Track，作为生物活性鉴定实验的对照。

1.3外周血DCs、T淋巴细胞和NK细胞的分离培养采集健康人志愿者外周抗凝血，梯度密度沉淀法常规分离白色云雾状狭带外周血单核细胞(PBMCs)。加入适量RPMI1640培养液重悬细胞，计数并调整细胞浓度为5×106个/mL，接种于6孔培养板，37 ℃、5%CO2培养4 h。用玻璃吸管将培养孔内的未贴壁细胞吸出，移至另一无菌离心管中，此吸出的细胞中富含大量的T淋巴细胞，调整细胞浓度至1×107个/mL，加入rhIL-2使其终浓度为20 U/mL，转入培养瓶中37 ℃、5%CO2培养。用梯度密度沉淀法常规分离PBMCs，PBS洗涤后计数细胞，每1×107细胞加入80 μL缓冲液和20 μL抗CD56免疫磁珠，4 ℃孵育15 min，加入1 mL的缓冲液，300 g离心10 min，弃上清，缓冲液重悬细胞后加入Mini MACS磁场中，进行磁珠分离，分选的CD56+细胞即为NK细胞。

用梯度密度沉淀法常规分离另一健康志愿者外周抗凝血，分离PBMCs，加入适量RPMI1640培养液重悬细胞，计数并调整细胞浓度为5×106个/mL，接种于6孔培养板，37 ℃、5%CO2培养4 h。用玻璃吸管将培养孔内的未贴壁细胞吸出，贴壁细胞每孔中加入RPMIl640培养液2 mL，加入终浓度为1 000 U/mL的GM-CSF和800 U/mL的IL-4，37 ℃、5%CO2培养，第3天贴壁细胞即为未成熟DCs(imDCs)，继续培养，培养的第5天加入终浓度为500 U/mL的TNF-α，培养至第9天为成熟DCs细胞。

1.4US3基因转染DCs培养生长状况良好的DCs细胞，接种于12孔板，每孔接种细胞1×105个，5% CO2、37 ℃培养24 h后弃去各孔细胞的旧培养液，将感染复数(MOI)分别为50、100和200的重组腺病毒液r-US3感染各孔细胞，每个浓度接种3个平行孔。5% CO2、37 ℃培养至48 h，在荧光显微镜下计数荧光细胞数和细胞总数，计算感染效率。以同样的方法，测定重组腺病毒r-Track的感染效率。当MOI为100时，重组腺病毒载体rUS3和r-Track对DCs的转染效率(90.15%±2.56%和91.83%±2.48%)较MOI为50时的转染效率(30.22%±2.32%和33.28%±3.57%)高(P均<0.05)，而与MOI为200时的转染效率(94.27%±3.33%和95.44%±2.40%)比较无统计学差异。为了尽可能地降低重组腺病毒对转染细胞的毒性，本研究在随后实验过程中采用了MOI为100的感染剂量。

1.5转染US3基因的DCs表型分析细胞分为4组：第5天的imDCs(imDCs组)、第9天成熟的DCs(正常对照组)、转染MOI为100的重组腺病毒r-US3的DCs细胞(r-US3组)、转染MOI为100的重组腺病毒r-Track的DCs细胞(r-Track组)，后两组细胞第7天转染，第9天用于测定表型。收集各组细胞，将其调整浓度至1×106个/mL。取DCs悬液100 μL，分别加入PE荧光标记的鼠抗人CD1α和CD86抗体各20 μL，混合均匀后，室温避光放置30 min，以同型阴性荧光标记抗体作为阴性对照。PBS液清洗2次，流式细胞仪检测DCs细胞。r-US3组、r-Track组、imDCs组、正常对照组CD86阳性的DCs分别占88.41%±5.32%、86.73%±5.60%、14.92%±4.68%、85.38%±4.47%，CD1α阳性分别占85.45%±6.04%、87.16%±6.05%、9.46%±2.73%、82.94%±6.62%，正常对照组与imDCs组比较，P均<0.05，r-US3组、r-Track组与正常对照组比较，P均>0.05。

1.6转染US3基因的DCs诱导的T淋巴细胞增殖活性检测将培养第7天生长状况良好的DCs分为r-US3组(转染r-US3的DCs细胞)、r-Track组(转染r-Track的DCs细胞)和正常对照组，分别加入MOI均为100的r-US3腺病毒RPMI培养液、r-Track腺病毒RPMI培养液和空白RPMI培养液，接种于6孔板，每孔接种细胞1×105个，37 ℃、5%CO2培养。感染48 h后，各组细胞中加入终浓度为50 μg/mL丝裂霉素C，晃动混匀，37 ℃、5%CO2培养45 min，PBS清洗，做为靶细胞。将另一志愿者分离所得的T淋巴细胞作为反应细胞，调整细胞浓度至1×106个/mL，100 μL/孔加入96孔板中，分别与上述3组靶细胞混合，效靶比为20∶1。此外，另设效应细胞阴性对照孔，以效应细胞自身为空白对照。各组反应总体积均为200 μL/孔，37 ℃、5%CO2培养。分别于混合培养后即刻及第24、48 h时，各组取3孔进行检测，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，晃动混匀，37 ℃、5%CO2孵育4 h，弃上清。每孔加入150 μL的DMSO，振荡10 min后，酶联免疫检测仪570 nm波长处测定各孔OD值，记录结果。最终将正常对照组培养0 h的T淋巴细胞增殖活性设为1，T淋巴细胞增殖活性=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(1-空白对照OD值)。

1.7转染US3基因的DCs对NK细胞杀伤活性的影响观察将培养生长状况良好的DCs细胞接种于12孔板，分为r-US3组、r-Track组和正常对照组，各组分别加入MOI为100的r-US3腺病毒RPMI培养液、r-Track腺病毒RPMI培养液和空白RPMI培养液培养48 h后作为靶细胞。混合NK细胞和靶细胞，效靶比为20∶1，另以NK细胞自身为空白对照。每组均设3个平行孔，NK细胞杀伤活性采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定。最终将正常对照组NK细胞杀伤活性设为100%， NK细胞杀伤活性(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照OD值)×100%。

1.8统计学方法采用SPSS10.0统计软件。计量资料进行正态性检验和方差齐性检验检验后，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组T淋巴细胞增殖活性比较见表1。r-US3组、r-Track组、正常对照组NK细胞杀伤DCs活性分别为87.67%±3.21%、103.02%±2.65%、100.00%，r-US3组与r-Track组、正常对照组相比，P均<0.05。

表1　各组T淋巴细胞增殖活性比较±s)

注：与正常对照组相比，*P<0.05；与r-Track组相比，#P<0.05。

3　讨论

DCs是机体免疫反应的始动者，是体内目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞(APC)，在基因治疗和免疫治疗中发挥着重要的作用，但免疫排斥反应是其面临的一个重要的障碍。DCs对T淋巴细胞和NK细胞均有激活功能[7]，DCs细胞能及时地摄取和加工各种抗原，形成主要组织相容性复合体(MHC)-抗原肽复合物，激活T细胞介导的免疫应答。此外，DCs还能高表达黏附分子和共刺激分子，分泌多种细胞因子，在细胞免疫中发挥关键作用[8]。随着高效转染基因工程的发展，基因治疗被系统地引入细胞移植，移植细胞具有了基因修饰的可能性[9]。将治疗基因导入细胞后移植于受体，既能满足移植的需要，又能通过转染、基因干扰或敲除等技术使移植细胞获得所需的特性，达到防治疾病的目的，但免疫排斥问题仍是其面临的一个主要问题，因此，通过基因修饰使移植细胞获得免疫逃逸的特性成为目前国内外针对免疫排斥的研究热点[10]。

病毒是典型的胞内感染，干扰感染细胞表面MHCⅠ类分子抗原呈递途径来逃避免疫清除的策略被许多病毒所利用，病毒对此途径的调节也就成为研究病毒逃逸免疫细胞杀伤机制的焦点之一[11]。现有研究[4,5]发现，病毒可通过各种机制干扰MHCⅠ类分子的成熟、组装和输出，作用于MHCⅠ类抗原肽复合物形成的各环节，在其生长周期的不同阶段均可以干扰MHCⅠ类抗原呈递，从而产生病毒逃逸，减少机体对病毒的清除。但是病毒感染细胞表面MHCⅠ类分子的表达与其对NK细胞的敏感性呈反比。病毒感染细胞在破坏或下调MHCⅠ类分子的同时，却成了NK细胞的攻击目标。因此单纯降低病毒感染细胞表面MHCⅠ类分子表达达不到理想的免疫逃逸效果。有研究[6]报道，HCMV编码的免疫调控基因片段US3基因既可以选择性下调NK细胞兴奋性受体的优势配体MHCⅠ-A和MHCⅠ-B，又可不对NK细胞抑制性受体的优势配体MHCⅠ-C和MHCⅠ-E产生影响，在逃逸CTL杀伤的同时还可避免NK细胞的免疫杀伤，有效逃逸宿主的免疫清除。

本研究通过分离健康人的PBMCs，在rhGM-CSF、IL-4和TNF-α的联合刺激培养下，成功地诱导出典型的DCs细胞。基于已有的研究基础和理论依据，本研究构建表达US3基因的腺病毒载体，转染DCs细胞，通过T淋巴细胞增殖实验和NK细胞杀伤实验，研究表达US3基因腺病毒载体的免疫逃逸活性。结果发现，重组腺病毒能够安全、高效地转染DCs细胞，并且重组腺病毒的转染对于DCs细胞的成熟表型不产生明显影响。为了尽可能地降低重组腺病毒对转染细胞的毒性，更好地研究其免疫活性，本研究采用了MOI为100的感染剂量。在随后的实验中，重组腺病毒r-US3和r-Track分别感染诱导成功的DCs后，与分离出的淋巴细胞混合培养，结果发现，与r-Track组和正常对照组相比，重组腺病毒r-US3组在混合培养24 h内和48 h内均能明显抑制DCs诱导的T淋巴细胞增殖活性。而r-Track组和正常对照组比较差异无统计学意义。此外，本研究又通过NK细胞杀伤活性实验检测重组腺病毒r-US3的免疫活性。结果发现，r-US3组能明显地降低NK细胞对转染DCs细胞的特异性杀伤活性，与正常对照组和r-Track组相比有统计学差异，而正常对照组和r-Track组比较差异无统计学意义。

可见，表达US3基因的重组腺病毒能够有效地抑制DCs诱导的T淋巴细胞增殖，同时降低NK细胞对转染DCs的免疫杀伤。这些结果在一定程度上提示，表达US3基因的腺病毒载体能够介导基因工程载体及其转染细胞的免疫逃逸，降低机体免疫系统对外源基因及其转染细胞的排斥反应，有利于目的基因的长期表达。

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Proliferation of T lymphocytes induced by DCs transfected with US3 gene and cytotoxic activities of NK cells

WANGXin1,WANGPeng,LILing,PANXue,YUZujiang,JIANGLili

(1NursingSchoolofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the proliferation of T lymphocytes induced by dendritic cells (DCs) transfected with US3 gene and cytotoxic activities of natural killer (NK) cells. MethodsTo construct adenovirus vectors expressing r-US3 or r-Track. DCs were separately cultured and then were divided into r-US3 group (r-US3-infected DCs), r-Track group (r-Track-infected DCs), and normal control groups. DCs in the three groups were mixed with T lymphocytes and the proliferation activity of T lymphocytes induced by DCs in each group was observed by MTT. In addition, DCs of three groups were mixed with NK cells, and cytotoxic activity of NK cells was tested using lactate dehydrogenase release assay. ResultsThe proliferation activities of T lymphocytes in r-US3 group, r-Track group and the control group were 1.250 0±0.062 4, 1.653 3±0.035 1 and 1.596 7±0.066 6, respectively at the 24th hour of mixed cultivation. When it came to the 48th hour, the proliferation activities of T lymphocytes were 1.823 3±0.066 6, 2.203 3±0.047 3 and 2.136 7±0.060 3, respectively. Compared with the r-Track group and control group, r-US3 significantly decreased the proliferation activities of T lymphocytes, allP<0.05. Cytotoxic activities of NK cells in the r-US3 group, r-Track group and the control group were 87.67%±3.21%, 103.02%±2.65% and 100.00%, respectively. Compared with the r-Track group and control group, r-US3 significantly decreased the cytotoxic activities of NK cells, allP<0.05. Conclusion The proliferation of T lymphocytes induced by DCs transfected by US3 gene and cytotoxic activities of NK cells are decreased.

dendritic cells; T-lymphocyte; natural killer cells; US3 gene; immune evasion

国家自然科学基金资助项目(81500433)；河南省教育厅自然科学研究计划项目(16A310003，12A310010)。

王昕(1972-)，女，副教授，主要从事免疫药理学的研究。E-mail: wangxinsfyy@126.com

简介：王鹏(1975-),女，教授，硕士生导师，主要从事免疫药理学的研究。E-mail： upliz@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.005

R392

A

1002-266X(2016)23-0016-04

2016-01-12)