高建林，陈　珺，李　兵，卢　丽，杨国柱，陆幸妍，李青南

(1.东莞康华医院药剂科，广东 东莞　523080；2.广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州　510006)



阿魏酸对体外培养的成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响

高建林1,2，陈珺2，李兵1，卢丽2，杨国柱2，陆幸妍2，李青南2

(1.东莞康华医院药剂科，广东 东莞523080；2.广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州510006)

阿魏酸；成骨细胞；细胞增殖；细胞分化；碱性磷酸酶；成骨基因

阿魏酸化学名称为3-甲氧基4-羟基丙烯酸，是当归等抗骨质疏松中药复方制剂的组方中药所含的一种水溶性单体成分，是其主要活性物质之一，具有降低胆固醇、抗氧化、抗血小板聚集等功能[1]。目前阿魏酸对心肌细胞、淋巴细胞活性影响的研究已有报道[1-3]，而其对成骨细胞活性影响的研究较为少见。该文研究阿魏酸对体外培养的成骨细胞增殖、分化功能的影响并探讨其作用机制，为当归等在防治骨质疏松症中的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料阿魏酸(浙江银和药业有限公司)，新生SD大鼠(广州中医药大学实验动物中心)。Dmem培养液(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，TRIzol(Invitrogen)，茜素红(浙江温州东升化工试剂厂)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)，碱性磷酸酶(AKP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养新生24 h内SD 大鼠,无菌条件下取出头盖骨, 剔除附着的结缔组织, 胶原酶消化后置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，取第三代细胞进行实验。

1.2.2细胞增殖与分化实验第3代成骨细胞以 1×107·L-1密度接种于96 孔板, 每孔100 μL , 24 h 后进行诱导培养。实验组阿魏酸浓度分别为40, 160, 640，2560 μmol·L-1, 对照组只加条件培养基。增殖实验组48 h后检测吸光度(OD), 检测波长450 nm, 参考波长630 nm。分化实验组培养48 h 后, 吸弃孔中的培养液, 经裂解后收集裂解液, 检测其吸光度, 检测波长490 nm, 参考波长630 nm。

1.2.3钙化功能检测与细胞增殖分化基因的表达成骨细胞以1×107·L-1的密度分别接种于24 孔培养板和100 mm 培养皿，24 h后进行诱导培养。实验分组同上。钙化功能检测组培养21 d后，镜下观察钙化结节的数量、体积及染色强度；基因表达检测组培养48 h后, 加TRIzol处理收集细胞，提取RNA进行RT-PCR 试验。

1.2.4统计学处理组间比较采用SPSS 13.0软件进行方差分析或t检验。

2　结果

与对照组比较，40、160、640、2560 μmol·L-1阿魏酸均可以促进成骨细胞的增殖与分化(P<0.05)。组间比较，细胞增殖方面，2560 μmol·L-1组可以促进成骨细胞增殖，与其他浓度组差异有显著性(P<0.01)；细胞分化方面，除了160与640 μmol·L-1浓度之间没有差异外，其他各组间都差异存在显著性(P<0.01)，见Tab 1，2。

Tab 1　Effects of ferulic acid on proliferation of ±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;△P<0.01vsgroup 2560

Tab 2　Effects of ferulic acid on differentiation of ±s，n=3)

*P<0.05vscontrol;△△P<0.01vsgroup 40;##P<0.01vsgroup 160;▲▲P<0.01vsgroup 640;DP<0.01vsgroup 2560

40～640 μmol·L-1阿魏酸可以增加钙化结节的数量，其中40 μmol·L-1组的数量最多；而到2 560 μmol·L-1浓度时，阿魏酸则不促进钙化结节的形成。40～2 560 μmol·L-1阿魏酸促进成骨相关指标AKP、Osteopotin、Collagen-Ⅰ等基因的表达，与对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。3讨论

以成骨细胞为研究对象，从中药中筛选治疗骨质疏松症可能的有效成分的研究已多有报道[4-6]，本文研究了当归等中药的有效成分阿魏酸对成骨细胞增殖、分化等功能的影响。结果显示：40～2 560 μmol·L-1阿魏酸与对照组比，均具有刺激成骨细胞增殖的作用(P<0.05)。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期特异性标志之一，阿魏酸4个浓度组的AKP活性均高于对照组，差异均具有统计学意义，表明阿魏酸在40～2 560 μmol·L-1浓度范围内具有促进成骨细胞分化的功能。通过Von kossa染色法检测成骨细胞钙化结节数目，可以反映细胞钙化程度[7]。在40～640 μmol·L-1浓度范围内，阿魏酸可以促进成骨细胞钙化结节的形成，而到2 560 μmol·L-1浓度时，其数量未见明显增加，这一点与AKP的结果不尽一致。钙化结节反映的是成骨细胞分化中晚期的情况，与分化早期AKP的结果不尽一致，表明2 560 μmol·L-1阿魏酸对于成骨早、晚期分化的作用存在差异，具体原因有待进一步的探讨。阿魏酸在40～2 560 μmol·L-1浓度范围内可以促进成骨相关基因AKP、Osteopontin、CollagenⅠ的表达。AKP基因检测的结果与其活性测定的数据一致，提示阿魏酸可以促进成骨细胞的分化。Osteopontin在骨基质矿化开始后开始增高，对成骨细胞与基质的吸附起重要作用[8]。CollagenⅠ是骨有机基质的主要成分，其表达与骨形成活性密切相关。40～2 560 μmol·L-1阿魏酸可以促进Osteopontin、CollagenⅠ的表达，与增值实验的结果一致，表明阿魏酸可以促进成骨细胞的增值与成熟。

综上所述，阿魏酸具有刺激体外培养的成骨细胞增殖、分化的功能，在一定浓度范围内还可以促进成骨细胞的钙化，作用机制可能与其增加成骨相关基因mRNA的表达有关。作为当归等中药的水溶性单提成分，其在防治骨质疏松症中可能具有一定的应用前景。

(致谢：感谢广东药学院生命科学与生物制药学院新药功能实验室贾欢欢、李英彬、张旭玲等同学给予的支持与帮助。)

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Effects of ferulic acid on proliferation, differentiation and mineralization of cultured osteoblastsinvitro

GAO Jian-lin1,2，CHEN Jun2，LI Bin1，LU Li2，YANG Guo-zhu2，LU Xin-yan2，LI Qing-nan2

(1.DeptofMedicine，DongguanKanghuaHospital，Dongguan,Guangdong523080，China；2.CollegeofLifeScienceandBio-pharmaceutics，GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

ferulic acid; osteoblast; cell proliferation；cell differentiation； alkaline phosphatase(AKP); osteogenic gene

时间：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.060.html

2016-07-05,

2016-09-12

国家自然科学基金资助项目(No 30971172)

高建林(1980-)，男，硕士，药师，研究方向：临床药学，E-mail：gjl1998@qq.com;

李青南(1956-)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：骨药理学，通讯作者，E-mail：qingnanli@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.030

A

1001-1978(2016)10-1479-02

R-332；R284.1；R329.24；R681.022