付　强，张静怡，胡健力，余　硕，包　斌，戴秋云，吴文惠

(1上海海洋大学食品学院，上海　201306；2 军事医学科学院生物工程研究所，北京　100071)



Hirulog-s纤溶酶促反应动力学的常数测定

付强1，张静怡1，胡健力1，余硕2，包斌1，戴秋云2，吴文惠1

(1上海海洋大学食品学院，上海201306；2 军事医学科学院生物工程研究所，北京100071)

Hirulog-s为军事医学科学院通过对水蛭素结构改造获得的一种新型合成水蛭肽，其序列为：(D)-FPRP-GK(Stearic acid)-GG-QGDFEPIPEDA-YDE-NH2，Hirulog-s半衰期达到T1/2=212.2±58.4 min[1]。水蛭素具有间接促进尿激酶诱导的纤溶作用[2]，为考察新型水蛭肽Hirulog-s 影响纤溶因子亲和性的程度,本文基于单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(pro-uPA)和纤溶酶原(plg)的相互活化作用[3]研究Hirulog-s通过酶促反应动力学参数体现出来的纤溶特性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂Hiruolg-s(纯度>98%)由军事医学科学院提供。单链尿激酶型纤溶酶原激活剂、纤溶酶原、尿激酶、牛血清白蛋白均购自美国Sigma公司，尿激酶发色底物S-2444购自法国BioMed公司。

实验仪器为酶标仪(SH-1000 CORONA)。

1.2Hirulog-s 纤溶酶促动力学参数测定方法参照党昕等[4]建立的方法对pro-uPA激活plg成纤溶酶(plm)，plm作用于pro-uPA成尿激酶(uPA)的反应进行酶促动力学分析。通过构筑不同浓度梯度的plg与pro-uPA反应体系，分别加入0、6、12、24、30 μmol·L-1的Hirulog-s(前期实验证明为理想活性范围)，来计算不同浓度Hirulog-s的Km,plm和kcat，pro-uPA值。

2　结果

在pro-uPA/plg/Hirulog-s反应体系中，改变pro-uPA和Hirulog-s的浓度，结果A405与t是二阶多项式的函数关系，二次项系数为A=0.5ε·L·kcat，uPA·v(uPA)，取反应初始阶段做二次回归。AHirulog-s→pro-uPA值确定后根据v(uPA)=2AHirulog-s→pro-uPA/a，计算v(uPA)。进行v(uPA)与[pro-uPA]的双倒数作图，经过线性回归后，用斜率除截距得到Km，plm，见Tab 1。

改变plg和Hirulog-s的浓度，同理求出二次项系数A，确定后根据v(uPA)=2AHirulog-s→plg/a，求出v(uPA)，再根据米氏方程v(uPA)=(Vm，plm·[pro-uPA])/(Km，plg+[pro-uPA])，求出不同浓度Hirulog-s影响下的Vm，plm，作Vm，plm-[plg]，经线性回归后，直线斜率即kcat，plm，见Tab 1。

Tab 1　The kinetic constants of

由Tab 1可以看出：随着Hirulog-s浓度的增加，kcat的值明显增加，表明Hirulog-s明显提高了plm的最大催化速率。反应中随着Hirulog-s浓度的增大，plm作用于pro-uPA的Km值逐渐降低，1/Km近似表示酶与底物亲和力，这表明Hirulog-s随着浓度的增加可以缓慢的增强plm对pro-uPA的亲和性。

3　讨论

由于本实验涉及了多个酶促反应，在我们的其他实验中发现利用plm的发色底物S-2251验证Hirulog-s对plg及plm的影响时，发现pro-uPA激活plg的反应中其酶促动力学常数Km、kcat均处于同一数量级，所以在计算plm对pro-uPA作用的时候忽略了pro-uPA激活plg反应的影响。应用本文所述的实验方法测定的Hirulog-s对plm作用于pro-uPA反应动力学常数Km系列值低于党昕等[5]报导的数值(Km=60.4 μmol·L-1)3个数量级，说明Hirulog-s的加入明显增强了反应的亲和性。反应的kcat值低于报导值(kcat=7.31 s-1)，说明纤溶酶原的浓度对反应活性影响较大，但是随着Hirulog-s的加入反应活性明显提高。

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Measuring kinetic constants of enhancing fibrinolysis of Hirulog-s

FU Qiang1,ZHANG Jing-yi1,HU Jian-li1,YU Shuo2,BAO Bin1,DAI Qiu-yun2,WU Wen-hui1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;2.InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

Hirulog-s；合成水蛭肽；纤溶作用；酶促反应动力学；催化常数；米氏常数

Hirulog-s；synthetichirudin；fibrinolysis；enzymatic reaction kinetics；catalytic constant；Michaelis constant

时间：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.058.html

2016-07-15,

2016-09-10

国家自然科学基金资助项目(No 81502955)

付强(1991-)，男，硕士生，研究方向：海洋生物资源利用，E-mail: m140208432@st.shou.edu.cn;

吴文惠(1965-)，男，博士，教授，研究方向：海洋生物资源利用，通讯作者，E-mail:whwu@shou.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.029

A

1001-1978(2016)10-1478-02

R341.6；R345；R973.2；R977.3；R977.6