姚磊 曾磊 付旭辉 汤华阳 李蔚然 陈刚 孙良丹 高敏 王培光 杨森 张学军

230022合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科 安徽医科大学皮肤病研究所（姚磊、曾磊、汤华阳、李蔚然、陈刚、孙良丹、高敏、王培光、杨森、张学军）；河南省开封市第二人民医院皮肤科（付旭辉）

·论著·

SASH1基因新杂合错义突变与遗传性泛发性色素异常症一家系相关

姚磊 曾磊 付旭辉 汤华阳 李蔚然 陈刚 孙良丹 高敏 王培光 杨森 张学军

230022合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科 安徽医科大学皮肤病研究所（姚磊、曾磊、汤华阳、李蔚然、陈刚、孙良丹、高敏、王培光、杨森、张学军）；河南省开封市第二人民医院皮肤科（付旭辉）

目的 探讨一家系遗传性泛发性色素异常症的临床特征和分子遗传学发病基础。方法 对该家系进行详细的遗传学调查、体检，并对先证者进行反射式共聚焦显微镜检查和组织病理学检查。采集8例家系成员（其中患者5例，正常个体3例）和200例家系外无亲缘关系的健康对照的血样，提取基因组DNA，PCR扩增SASH1和ABCB6基因的全部外显子及其侧翼序列，并进行DNA直接测序。结果 该家系符合常染色体显性遗传模式。家系中9例患者均在出生后1年内发病，皮损最初累及面部，后逐渐泛发于全身。健在的8例患者中，7例皮损表现为不规则淡褐色至深褐色色素沉着斑，其余皮肤呈均匀的色素减退。仅先证者大姐皮损表现为泛发性网状色素沉着斑和色素减退斑。患者的口腔黏膜、指（趾）甲、牙齿和一般健康状况均正常。DNA测序显示，5例患者SASH1基因第15号外显子上均出现1个杂合错义突变（c.1761C＞G，p.Ser587Arg），而家系中3例正常个体及家系外200例健康对照均未检测到此突变。此外，均未发现ABCB6基因突变。结论 遗传性泛发性色素异常症的临床特征和分子遗传学发病基础存在异质性。SASH1基因的p.S587R突变可能是该家系患者发病的原因。

常染色体显性；杂合子；突变；遗传学；汉族；基因，SASH1；遗传性泛发性色素异常症

遗传性泛发性色素异常症（dyschromatosis universalis hereditaria，DUH）是一种临床上少见的遗传性色素异常性皮肤病，其临床特征是皮肤和（或）黏膜泛发形状及大小各异、颜色深浅不一呈网状排列的色素沉着斑和色素减退斑。本病于1933年由日本学者Ichikawa和Hiraga首次描述，迄今已经报道至少50例，来自十多个国家，其中大多为家系，少数为散发病例。根据连锁定位区域的不同，OMIM收录3种DUH类型，分别为DUH1（OMIM 127500，6q24.2-q25.2）、DUH2（OMIM 612715，12q21-q23）和DUH3（OMIM 615402，2q35），其中，DUH1 和DUH3呈常染色体显性遗传，而DUH2为常染色体隐性遗传［1-3］。目前研究发现，ABCB6 基因和SASH1 基因突变与DUH发病相关［3-4］。我们对一DUH家系开展临床特征和分子遗传学研究。

对象与方法

一、对象

DUH家系来自河南省，共4代15人，其中患者9例，包括男性患者4例和女性患者5例。在征得知情同意后，对DUH家系进行遗传学调查和体检，并对先证者进行皮肤反射式共聚焦显微镜检查和皮肤组织病理学检查。采集家系中5例患者和3例正常个体的血样5 ml用于分子遗传学研究，并采集200例无亲缘关系的健康人外周静脉血5 ml作为对照。

二、方法

1.皮肤反射式共聚焦显微镜检查：选择先证者前臂的色素沉着斑和腹部色素减退斑两处典型皮损，应用波长830 nm的Vivascope 1500皮肤反射式共聚焦显微镜观察皮损表皮和真皮浅层中色素变化情况。

2.皮肤组织病理学检查：切取先证者前臂色素沉着斑和腹部色素减退斑两处皮损，行HE染色和Melan-A染色。

3.DNA提取：采用德国Qiagen公司的Flexi基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

4.PCR引物设计：从基因库数据（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank）分别获取ABCB6和SASH1基因的参考序列，用Primer Premier 5.0软件设计基因编码区及其两侧50个碱基以上与内含子交界区域的引物；再利用UCSC网站的PCR页面（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）进行引物特异性的检验，最后送美国Invitrogen公司进行引物合成。其中，SASH1基因第15号外显子引物：上游5′-AGGTCACTCAGAGGGGTGA-3′，下游 5′-CTTACGC TATCACCCACAGC-3′。

5.PCR扩增及DNA测序：PCR反应体系15 μl，包含基因组DNA 50 ng，上下游引物各5 pmol，dNTPs 0.3 μl，Taq DNA 聚合酶 0.3 μl，25 mmol/L MgCl20.9 μl，缓冲液 1.5 μl，Qmix 3.0 μl。降落式PCR反应程序：94℃预变性5 min后，进行以下12个循环：94℃变性30 s，65℃退火40 s（退火温度每个循环降低0.5℃），72℃延伸30 s；接着进行后25个循环：94℃变性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 30 s，共37个循环，最后72℃延伸10 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测产物条带是否均一明亮。纯化后的PCR产物以Sanger双脱氧链终止法为原理应用ABI 3730XL测序仪进行测序。

6.SASH1蛋白功能预测：对人、黑猩猩、长臂猿、小鼠、大鼠、家兔、牛、斑马鱼、鸭嘴兽和矛尾鱼10种物种的SASH1蛋白序列进行比对。应用SIFT和Polyphen-2软件预测p.Ser587Arg突变点是否为有害突变。

结 果

一、DUH家系的临床特征

家系图显示该DUH家系共4代15人，每代均有发病，男性患者和女性患者例数相近。患者的双亲之一亦是患者，符合常染色体显性遗传模式（图1）。家系中9例患者均在出生后1年内发病，皮损初发于面部，后逐渐泛发全身。此后皮损不随年龄增长而变化。体检：先证者全身泛发不规则淡褐色至深褐色色素沉着斑，直径约2～5 mm，其中部分呈星芒状。色素沉着之外的皮肤呈均匀的色素减退（图2）。仅先证者大姐表现为泛发性网状色素沉着斑和色素减退斑（图3）。健在的8例患者的掌跖、黏膜、指（趾）甲及牙齿均未受累，体格及智力各方面均发育正常。先证者反射式共聚焦显微镜检查显示：色素沉着斑处基底层色素含量增多，呈高折光性，有多个明亮完整的色素环（图4A）；色素减退斑处基底层色素缺失，折光减弱或无折光性，色素环缺如或部分可见残存色素环（图4B）。先证者皮损组织病理学检查：色素沉着斑处表皮基底层黑素增多（图4C），色素减退斑处表皮基底层色素显著减少，黑素细胞数量正常（图4D）。先证者色素沉着皮损处Melan-A染色示表皮内的黑素细胞数量和分布正常（图4E）。

图1 家系图 图中黑色箭头代表此家系的先证者，a：代表采血并测序的样本

图2 先证者面部（2A）、背部（2B）和四肢（2C）泛发性淡褐色至深褐色色素沉着斑，边缘不规则，其余皮肤为广泛的色素减退

图3 先证者大姐的临床特征 面部（3A）、背部（3B）网状的色素沉着斑和色素减退斑

图4 先证者皮损 反射式共聚集显微镜和组织病理学特征 4A：色素沉着皮损：基底层色素增多，折光强，色素环明亮完整；4B：色素减退皮损：基底层色素缺失，色素环缺如或部分可见残存色素环（50 μm）；4C：色素沉着皮损组织病理：表皮基底层黑素增多（×400）；4D：色素减退皮损：基底层色素减少（HE × 200）；4E：色素沉着皮损：黑素细胞在表皮基底层数量正常（Melan-A染色 ×400）

二、DNA直接测序

对ABCB6和SASH1两个基因全部外显子和侧翼序列进行PCR扩增测序后发现，5例患者SASH1基因第15号外显子上第1761位碱基胞嘧啶（C）杂合突变为碱基鸟嘌呤（G）（c.1761C＞G），导致相对应的中性氨基酸丝氨酸（S）变为带正电荷的碱性氨基酸精氨酸（R）（p.Ser587Arg）（图 5A）；家系中的 3 例正常个体及家系外200例无亲缘关系的健康对照均未检测到此突变（图5B）。家系中5例患者及3例正常个体均未检测到ABCB6基因突变。

三、SASH1蛋白功能预测

物种间序列比对分析发现，SASH1蛋白第587位丝氨酸序列为进化高度保守的序列。SIFT软件对p.Ser587Arg功能预测结果为Affect Protein Function（score=0.03），Polyphen-2的预测结果为 Probably Damaging（score=0.998）。SIFT和Polyphen-2预测软件分析该点突变为有害变异位点。

讨 论

常染色体显性DUH通常在出生时或出生后的1年内开始发病，皮肤出现泛发性色素沉着斑和色素减退斑，网状排列，呈现斑驳状外观。色素斑直径2～5 mm，边缘不整齐，呈星芒状，色素沉着为淡褐色至深褐色不等，多累及躯干和四肢，50%累及面部，掌跖、黏膜、指（趾）甲及牙齿受累者较罕见。部分DUH患者还可伴身材矮小、智力障碍、高频耳聋、癫痫、结节性硬化症［5］、“刀砍样”硬皮病［6］等缺陷。在本例家系中，健在的8例患者中7例皮损表现为泛发性淡褐色至深褐色斑疹，其余皮肤为均匀的色素减退，未有呈现网状排列的外观，临床上容易误诊为家族性进行性色素沉着症或泛发性雀斑样痣。皮损组织病理学显示，表皮基底层黑色素增多或减少，而黑素细胞数量、结构正常。

图5 患者及对照SASH1基因测序结果 5A：家系患者出现SASH1基因的杂合错义突变（箭头）c.1761C＞G（p.S587R）；5B：家系正常个体和健康对照该位点测序图

Kim等［7］认为，黑素细胞的合成速率异常和（或）黑素小体分布缺陷是导致DUH的原因。2003年，Xing等［1］将2例常染色体显性汉族DUH家系（Xing等诊断为 DSH。Miyamura 等［8］认为应是 DUH）致病基因定位于6q24.2-q25.2上约10.2 Mb的区域。2013年，Zhou等［4］对3例无亲缘关系的汉族人DUH家系中的先证者在该定位区域内进行候选基因测序，发现SASH1基因编码区的3种杂合错义突变，分别为 c.2126T＞G（p.Tyr551Asp）、c.2019T＞ C（p.Leu515Pro）及 c.2000G ＞ A（p.Glu509Lys）。同年，Zhang等［3］对1例5代汉族人常染色体显性DUH大家系进行全基因组连锁定位和外显子测序，结果发现位于2q33.3-q36.1区域的ABCB6基因发生1个杂合错义突变c.1067T＞C（p.Leu356Pro）。此外在6例散发病例中的2例检测到ABCB6基因的另外2种杂合错义突变，即 c.508A＞G（p.Ser170Gly）和c.1736G＞A（p.Gly579Glu）。此后，国内多个研究小组在DUH家系或散发病例中检测到ABCB6基因突变［9-11］。本研究结果证实，Zhou 等［4］的研究发现，c.1761C ＞G（p.Ser587Arg）为 SASH1基因一个新的突变位点。

SASH1基因定位于染色体6q24.3区域，全长7 709bp，包含20个外显子，其编码蛋白是由1247个氨基酸组成的SLY家族的信号衔接蛋白，相对分子质量为137 000，包含1个SH3功能域和2个SAM功能域。1个SH3结构域由第557～613位氨基酸组成，2个SAM结构域分别由第633～698位氨基酸和第1 173～1 242位氨基酸组成。SH3结构域能识别脯氨酸富集基序，参与蛋白间相互作用。2003年，Zeller等［12］研究乳腺癌发现，SASH1 基因为一种潜在的肿瘤抑制基因，此后陆续发现SASH1表达降低与多种恶性肿瘤的细胞生长、增殖和远处转移密切相关。此外，SASH1还参与多种信号转导通路的调节［13-15］。突变的 SASH1蛋白通过增加与Gαs和IQGAP1的结合导致E钙粘素表达减少，引起DUH发病过程中黑素细胞特定的迁移和分布［4］。ABCB6位于染色体2q36区域，全长3021bp，包含19个外显子，其编码蛋白为842个氨基酸组成的ATP结合盒半转运蛋白，包含2个保守的ABC转运体跨膜功能域和1个保守的ATP结合盒功能域。Jalil等［16］指出ABCB6蛋白以糖基化蛋白的形式锚定于胞内囊泡膜上，参与细胞内外的物质转运，维持金属离子的体内平衡，尤其是金属铜离子。铜离子是酪氨酸酶的协同因子，在启动黑素小体合成黑素中发挥重要的作用。

本文5例患者均出现与临床表型共分离的SASH1基因上的1个新的杂合错义突变c.1761C＞G（p.Ser587Arg）。野生型第587位丝氨酸残基位于高度保守的SH3功能域上，是肽配体结合区之一。该点突变经过SIFT和Polyphen-2软件预测均为有害性变异位点，提示S587R突变可能影响SASH1蛋白的正常功能。先证者皮损Melan-A染色显示黑素细胞在表皮中的数量和分布均正常，因此，该家系DUH的色素异常可能与黑素细胞中的黑素向周围角质形成细胞的转运障碍有关。

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A novel heterozygous missense mutation in the SASH1 gene is associated with dyschromatosis universalis hereditaria in a pedigree

Yao Lei,Zeng Lei,Fu Xuhui,Tang Huayang,Li Weiran,Chen Gang,Sun Liangdan,Gao Min,Wang Peiguang,Yang Sen,Zhang Xuejun
Institute of Dermatology and Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022,China（Yao L,Zeng L,Tang HY,Li WR,Chen G,Sun LD,Gao M,Wang PG,Yang S,Zhang XJ）;Department of Dermatology,Second People′s Hospital of Kaifeng City,Kaifeng 475000,Henan,China（Fu XH）

ObjectiveTo investigate clinical features and molecular genetic basis of dyschromatosis universalis hereditaria（DUH）in a pedigree.MethodsA detailed genetic survey and a physical examination were performed for available members in a pedigree with DUH.In addition,reflectance confocal microscopy and histopathology were carried out to observe skin lesions of the proband.Blood samples were collected from 8 family members（including 5 patients with DUH and 3 unaffected members）and 200 unrelated healthy human controls.The FlexiGene DNA kit was used to extract genomic DNA from these blood samples,and PCR was performed to amplify all coding exons and their flanking sequences of SASH1 and ABCB6 genes followed by direct DNA sequencing.ResultsDUH was inherited in an autosomal dominant manner in this pedigree,and occurred within 1 year after birth in 9 patients.Lesions initially appeared on the face,then gradually spread to the whole body.Among 8 surviving patients,7 presented with irregularly shaped light brown to puce macules complicated by uniform hypopigmentation of the remaining skin,and only the elder sister of the proband showed generalized hyperpigmented macules mingled with hypopigmented macules in a reticular pattern.No abnormality was observed in oral mucosa,nails or teeth,and general status was good in the 8 patients.DNA sequencing revealed a novel heterozygous missense mutation（c.1761C＞G,p.Ser587Arg）in exon 15 of the SASH1 gene in the 5 available patients,but not in the 3 unaffected individuals or 200 healthy controls.No mutation was found in the ABCB6 gene in any of the 8 family members.ConclusionsHeterogeneity exists in clinical features and molecular genetic basis of DUH.The heterozygous missense mutation p.S587R in the SASH1 gene might be responsible for DUH in this family.

Autosomal-dominant;Heterozygote;Mutation;Genetics;Han nationality;Genes,SASH1;Dyschromatosis universalis hereditaria

Wang Peiguang,Email：wpg2370@163.com

2015-07-20）

（本文编辑：吴晓初）

王培光，Email：wpg2370@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.001