粟秋平，杨凯，涂白杰

（重庆医科大学公共卫生与管理学院环境卫生与劳动卫生教研室，重庆400016）

·论著·

苯并［a］芘对大鼠自主活动及运动协调能力的影响*

粟秋平，杨凯，涂白杰△

（重庆医科大学公共卫生与管理学院环境卫生与劳动卫生教研室，重庆400016）

目的探讨苯并［a］芘（B［a］P）亚慢性染毒对大鼠自主活动及运动协调能力的影响。方法选取30只雄性SD幼鼠，鼠龄3～4 d，随机分为空白组，溶剂组（1.00 mL/kg植物油），B［a］P染毒低剂量组（0.02 mg/kg）、中剂量组（0.20 mg/kg）及高剂量组（2.00 mg/kg），每组6只。适应饲养环境后按相应浓度持续灌胃7周。染毒结束后测量SD大鼠体质量变化。通过记录其在旷场实验中的爬行总格子数、直立次数和粪便颗粒数，以及在足迹实验中的后跟脚印轨迹等相应指标，评估SD大鼠自主活动及运动协调能力。结果染毒结束后，B［a］P各剂量染毒组SD大鼠生长发育迟缓，表现为体质量均明显低于空白组和溶剂组，爬行总格子数及直立次数较空白组和溶剂组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而五组大鼠在足迹实验中步宽、步长、步态及角度变化4项参数指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 B［a］P可抑制SD幼鼠的生长发育，促进其自主活动，但对其运动协调能力作用不明显。

苯并芘类/毒性；神经行为学表现；自主活动；运动协调能力；大鼠，Sprague-Dawley

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，B［a］P）及其衍生物是国际公认的化学诱变剂和人类致癌物［1］，其主要来源于有机物的不完全燃烧。B［a］P除具有致癌性外，还具有一定的神经毒性。B［a］P可以透过血-脑屏障进入脑组织，当暴露于高水平时，B［a］P及其代谢物可在血液和大脑中累积［2］，从而对机体产生神经毒性作用，可通过行为表现［3］。国内外相关研究表明，B［a］P的神经毒性作用主要表现为对学习记忆能力的影响，而对自主活动及运动协调能力的影响研究甚少。故本研究拟在前期研究的基础上，通过对SD幼鼠B［a］P亚慢性染毒的观察，进一步探讨B［a］P的神经毒性，并初步探讨其对动物自主活动及运动协调能力的影响。

1　材料与方法

1.1动物与试剂健康雄性SD幼鼠30只，鼠龄3～4 d，由重庆医科大学动物中心提供。B［a］P购自美国Sigma公司（纯度98%）。

1.2方法

1.2.1试剂准备将B［a］P（纯度98%）溶于植物油4℃超声30 min后配制成1 mg/mL溶液备用。

1.2.2实验动物及处理30只健康雄性SD幼鼠饲养于重庆医科大学动物房，动物房自然采光，室温（22±2）℃，湿度（50±10）%，幼鼠自由进食和饮水。将幼鼠按B［a］P 0.02、0.20、2.00 mg/kg随机分为低、中、高3个剂量染毒组及空白对照组（空白组）和溶剂对照组（溶剂组），每组6只。适应饲养环境后，染毒组按B［a］P低、中、高3个剂量，溶剂组按1.00 mL/kg植物油持续灌胃处理7周，空白组不做处理。动物断乳前与母鼠一起，断乳后分笼饲养，不影响实验。每天记录幼鼠体质量变化及一般活动情况。

1.2.3行为学实验灌胃染毒7周后，参照文献［4-7］方法并做适当调整，对每组SD大鼠进行行为学实验以检测其自主活动及运动协调能力。

1.2.3.1旷场实验自制长61 cm、宽41 cm、高26 cm的木箱，在底部刻出8 cm×8 cm方格35个。先让各组SD大鼠在木箱中适应5 min，移除木箱中的粪便，喷洒75%乙醇掩盖气味。每次实验将SD大鼠轻放入木箱同一端的中间位置，记录其1 min内活动情况并记录以下指标：爬行总格子数、直立次数及排泄粪便颗粒数。每次实验后将粪便清除，并喷洒75%乙醇。

1.2.3.2足迹实验在测试盒的底层垫1张长60 cm、宽9 cm的吸水白纸，将SD大鼠两后足蘸适量无毒墨水后放入盒中，使SD大鼠从纸的一端走到另一端，形成一串连续的脚印。参照文献［5-6］测定以下指标：从右侧脚印中点做一条垂直于行进方向的直线，用①表示，相邻两右侧脚印之间的连线与①之间所形成的角为α，表示连续右侧脚印连线与①之间夹角的角度变化，即计算连续各角之间差值绝对值的平均值用△α表示，从第1个右脚脚印开始计算；相邻两右脚印之间的距离用②表示；左右两脚印之间的距离用③表示；β表示步态变化，用④表示，描述步态交替的均匀性，即β=0.5-③/②绝对值的平均值；步态宽度用⑤表示，是相对左右步之间的平均横向距离，即左侧脚印到右侧相邻两脚印连线的垂直距离。步长=总共步行的距离/步数。计算脚印时前面2个和最后2个脚印不用于本实验分析。

1.3统计学处理运用SPSS21.0统计软件进行数据分析，实验数据以±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，则采用非参数Kruskal-WallisH秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1动物体质量基本情况染毒结束后，B［a］P低、中、高各剂量染毒组SD大鼠的体质量［（142.60±3.72）、（124.73±4.14）、（116.33±5.81）g］较空白组和溶剂组［（170.20±7.50）、（152.80±7.33）g］明显减轻，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2动物行为学表现

2.2.1五组SD大鼠旷场实验中各行为学指标比较五组SD大鼠爬行总格子数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；各剂量染毒组SD大鼠爬行总格子数分别较空白组增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与溶剂组比较，高剂量组SD大鼠爬行总格子数增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。五组SD大鼠直立次数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），各剂量染毒组SD大鼠直立次数分别较空白组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），且中、高剂量组SD大鼠直立次数分别与溶剂组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。五组SD大鼠的粪便颗粒数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图1　B［a］P亚慢性染毒后对照组与各剂量染毒组体质量箱式图

表1　五组SD大鼠旷场实验中各行为学指标比较（±s）

表1　五组SD大鼠旷场实验中各行为学指标比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与溶剂组比较，bP＜0.05。

组别空白组溶剂组低剂量组中剂量组高剂量组爬行总格子数（格）直立次数（次）粪便颗粒数（颗）20.72±7.03 26.56±11.44 34.33±8.67a36.06±15.35a43.28±10.20ab5.77±1.03 5.88±2.75 8.89±1.87a9.00±3.47ab9.39±3.02ab1.00±1.67 1.17±1.17 1.50±1.23 1.83±2.04 3.17±2.23

2.2.2五组SD大鼠足迹实验中各行为学指标比较五组SD大鼠在足迹实验中步宽、步长及步态、角度变化4个参数指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　五组SD大鼠足迹实验中各行为学指标比较（±s）

表2　五组SD大鼠足迹实验中各行为学指标比较（±s）

组别空白组溶剂组低剂量组中剂量组高剂量组步宽（mm）步长（mm）步态变化（β）角度变化（△α）31.87±9.07 31.74±10.33 22.03±2.78 25.15±6.65 27.53±10.10 47.93±12.26 48.71±9.25 47.78±14.09 43.01±4.39 47.31±9.29 0.28±0.19 0.17±0.10 0.12±0.04 0.15±0.07 0.16±0.10 1.25±0.85 1.13±0.89 1.29±1.11 0.29±0.29 0.17±0.33

3　讨论

人体接触有机污染物主要通过食物和饮水，故本实验采取灌胃法染毒模拟人体接触外界污染物的方式进行实验观察。本实验设计的B［a］P染毒剂量为0.02、0.20、2.00 mg/kg，与人体接触环境污染水平相对应［8］，也与以往研究剂量一致［9-10］。通过SD幼鼠7周灌胃染毒后发现，各剂量染毒组SD大鼠均出现生长发育迟缓现象，表现为体质量较空白组和溶剂组明显减轻，提示B［a］P亚慢性染毒可抑制SD幼鼠的生长发育。

神经和行为学的研究方法很多，其中行为测试方法作为神经系统功能的敏感测量方法，能反映神经系统整合的输出情况［11］。行为学评估内容主要包括动物的自主行为、肌力和协调运动能力，以及学习和记忆能力。

旷场实验又称敞箱实验，由美国心理学家Hall于1934年首次研究设计，是一种评价啮齿类实验动物自主运动行为、探究行为与紧张焦虑程度的方法。本研究参照以往研究方法，利用自制木箱，人工记录SD大鼠的自发活动及变化，根据文献［4-5］计算出相应指标，对各项指标进行分析。粪便颗粒主要反映SD大鼠在木箱中的焦虑程度［12］，本研究结果显示，各剂量染毒组与对照组粪便颗粒数比较无明显变化，提示B［a］P可能对其焦虑无明显影响。水平运动及垂直运动次数主要用于衡量啮齿类实验动物自主活动的强弱［5］。本研究对大鼠水平运动及垂直运动指标的分析结果显示，各剂量染毒组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示B［a］P染毒对SD大鼠自主活动及探索行为有影响；进一步分析发现，染毒组大鼠的水平运动及垂直运动较空白组呈增加趋势，说明B［a］P染毒对SD大鼠自主活动及探索行为有促进作用。与文献［9］报道的B［a］P亚慢性处理幼鼠在出生36 d后自发活动明显增加，在69 d自发活动增加最为明显的结果一致。

足迹实验是通过步态模式和步长异常来反映动物共济运动能力［5］。本研究根据文献［6-7］计算并分析出各个实验动物的步宽、步长、步态变化及角度变化（△α），结果显示，对照组与各剂量染毒组4项参数指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示B［a］P对动物的共济运动能力影响不明显。其原因可能是B［a］P在体内的蓄积还未达到临床“疾病”的程度，尚处于亚临床状态。目前国内外有关B［a］P对啮齿类动物共济运动能力的相关研究报道较少，本研究虽发现各组间共济运动能力表现不明显，但若要进一步探索，尚需进行更长时间的染毒实验观察。

综上所述，本研究发现，B［a］P亚慢性染毒可抑制SD幼鼠的生长发育，促进其自主活动，但对其运动协调能力无明显影响。B［a］P对共济运动能力的影响有待通过更长时间的染毒实验并结合人群流行病学调查进一步确认。

［1］宾晓农，谭敏，吕嘉春，等.基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因［J］.中国公共卫生，2006，22（11）：1350-1352.

［2］Grova N，Schroeder H，Farinelle S，et al.Sub-acute administration of benzo［a］pyrene（B［a］P）reduces anxiety-related behaviour in adult mice and modulates regional expression of N-methyl-d-aspartate（NMDA）receptors genes in relevant brain regions［J］.Chemosphere，2008，73（Suppl 1）：S295-302.

［3］Zhang W，Tian F，Zheng J，et al.Chronic administration of benzo（a）pyrene induces memory impairment and Anxiety-Like behavior and increasesofNR2BDNAmethylation［J］.PLoSOne，2016，11（2）：e0149574.

［4］Ribeiro RP，Santos DB，Colle D，et al.Decreased forelimb ability in mice intracerebroventricularly injected with low dose 6-hydroxidopamine：a model on the dissociation of bradykinesia from hypokinesia［J］.Behav Brain Res，2016，305：30-36.

［5］曾莉，张旻，卜碧涛．实验啮齿类动物行为学评估［J］．神经损伤与功能重建，2008，3（5）：352-356．

［6］Simon D，Seznec H，Gansmuller A，et al.Friedreich ataxia mouse models with progressive cerebellar and sensory ataxia reveal autophagic neurodegenerationindorsalrootganglia［J］.JNeurosci，2004，24（8）：1987-1995.

［7］Oliver PL，Keays DA，Davies KE.Behavioural characterisation of the robotic mouse mutant［J］.Behav Brain Res，2007，181（2）：239-247.

［8］Mumtaz MM，George JD，Gold KW，et al.ATSDR evaluation of health effects of chemicals.Ⅳ.Polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）：understandingacomplexproblem［J］.ToxicolIndHealth，1996，12（6）：742-971.

［9］Chen C，Tang Y，Jiang X，et al.Early postnatal benzo（a）pyrene exposure in Sprague-Dawley rats causes persistent neurobehavioral impairments that emerge postnatally and continue into adolescence and adulthood［J］. Toxicol Sci，2012，125（1）：248-261.

［10］Maciel ES，Biasibetti R，Costa AP，et al.Subchronic oral administrationof Benzo［a］pyreneimpairsmotorandcognitivebehaviorandmodulatesS100B levels and MAPKs in rats［J］.Neurochem Res，2014，39（4）：731-740.

［11］王心如．毒理学基础［M］．6版．北京：人民卫生出版社，2012：374-388．

［12］高志，赵海苹，罗玉敏，等．小鼠脑缺血神经功能障碍行为学评价的研究进展［J］．中国比较医学杂志，2012，22（11）：68-72．

Effects of benzo［a］pyrene on autonomic activity and motor coordination in rats*

Su Qiuping，Yang Kai，Tu Baijie△
（Teaching and Researching Section of Environment Health and Labor Hygiene，School of Public Health and Management，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo explore the effect of subchronic exposure to benzo［a］pyrene（B［a］P）on autonomic activity and motor coordination in rats.MethodsThirty male juvenile rats，aged 3-4 d，were randomly divided into the blank group，solvent group（1.00 mL/kg plant oil），B［a］P low-dose group（0.02 mg/kg），B［a］P medium-dose group（0.20 mg/kg）and B［a］P high-dose group（2.00 mg/kg），6 cases in each group.After acclimatizing the feeding environment，the rats were intragastrically administrated for 7 consecutive weeks according to corresponding concentration.After exposure to toxicant，the body weight of rat was measured. The open field test and foot printing test were conducted to evaluate the autonomic activity and motor coordination of rats，respectively.The total number of crawling lattice，up-right times and fecal particles number in the open field test were recorded.Meanwhile，the heel footprints track in the foot printing test were also recorded.ResultsAfter exposure to toxicant，the growth and development of SD rats in each contamination group were delayed，which showed that the body weight of each contamination group was significantly lower than that in the blank group and the total number of crawling lattice and upright times in each contamination group was significantly increased when compared with the blank group and the solvent group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.However，there were no statistically significant differences in the step width，step size，gait changes and angle changes among the five groups（P＞0.05）.ConclusionB［a］P can inhibit the growth and development of juvenile rats and promotes their autonomic activity，but has not obvious effect on the motor coordination.

Benzopyrenes/toxicity；Neurobehavioral manifestations；Autonomic activity；Motor coordination；Rats，sprague-dawley

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.003

A

1009-5519（2016）20-3103-03

国家自然科学基金资助项目（81372957）。

粟秋平（1989-），在读硕士研究生，主要从事职业卫生与环境卫生研究。△

，E-mail：baijietu@hotmail.com。

（2016-09-05）