杜兴雨 ，王彦妮 ，张焱如 ，曹俊伟

（1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区生物制造重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

不同浓度玻璃化冷冻保护液及冷冻载体对驴卵母细胞成熟率的影响

杜兴雨1，2，王彦妮1，2，张焱如1，2，曹俊伟1，2

（1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区生物制造重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

为了比较不同冷冻液及冷冻载体对驴卵母细胞成熟率的影响，试验设计4个浓度梯度（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）冷冻液和3种冷冻载体分别对生发泡（germinal vesicle，GV）期驴的卵母细胞进行玻璃化冷冻，对解冻后的卵母细胞进行体外成熟，通过比较卵母细胞的成熟率反映其冷冻效果。结果表明，冷冻液Ⅱ的卵母细胞成熟率（28.13%）显著（P＜0.05）高于其他 3 组，但显著（P＜0.05）低于正常组（51.77%），在不同冷冻载体对驴卵母细胞成熟率的影响试验中，使用开放式拉长塑料细管（OPS）的卵母细胞成熟率（28.13%）显著（P＜0.05）高于普通玻璃细管组（11.67%），但与 GMP 管组（23.53%）差异不显著（P ＞0.05）。

驴；玻璃化冷冻；卵母细胞；成熟率；载体

随着体外受精及体细胞核移植技术的日益成熟，科研人员对卵母细胞的需求量日益增加［1］，加之人工授精及受精后胚胎的发育、基因工程、体细胞克隆、濒危动物的保存等都需要大量的卵母细胞，所以卵母细胞的冷冻保存就成了当今的热点研究内容，卵母细胞的冷冻方法大体分为程序化冷冻和玻璃化冷冻2种方法，而程序化冷冻因其昂贵的设备及繁琐的操作未被广泛使用，玻璃化冷冻最早是由Rall提出来的，玻璃化冷冻以快速、操作简单而著称，因此省去了繁琐的冷冻步骤及昂贵的仪器设备，从而大大减少了冷冻的成本［2］，同时玻璃化冷冻过程中高浓度的保护剂由液态迅速转化成玻璃态，从而减少甚至没有冰晶的形成，保护了卵母细胞不受物理损伤，其冷冻效果优于程序化冷冻而被广泛应用于生产及科研中。该研究以驴的卵母细胞为冷冻对象，分别设计4个浓度的冷冻保护液以及选用了3种不同冷冻载体，旨在分析不同浓度冷冻保护液及不同载体对生发泡 （germinal vesicle，GV）期驴卵母细胞成熟率的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢：驴卵巢采自青岛市胶南区周边屠宰场。将刚屠宰后的驴卵巢取出并置于4℃的生理盐水（含100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素）中，2～4 h内运回实验室。

1.1.2 开放式拉长塑料细管 （open pulled straw，OPS）的制作：选用规格为0.25 mL的冻精管，将加热台预热到100℃左右，然后将冻精管的中间部分放在加热台上均匀加热，双手轻拉使其长度为30cm左右，保持拉力5 s左右使其变硬，用手术刀将其中间切开，这样就得到2根细管，放在75%的酒精中过夜备用。

1.1.3 GMP管的制作：用的材料为0.25 mL的玻璃管，将玻璃管在酒精灯上加热后拉长至直径为0.85 mm左右，切断后浸在75%酒精中过夜备用。

1.2 主要试剂和溶液的配制

1.2.1 玻璃化冷冻保护液

玻璃化冷冻保护液按梯度分为4组，分别为：Ⅰ组25%DMSO+25%EG+50%M199+0.25 mol/L Sucrose；Ⅱ组20%DMSO+20%EG+60%M199+0.25 mol/L Sucrose；Ⅲ组 15%DMSO+15%EG+70%M199+0.25 mol/L Sucrose；Ⅳ组 10%DMSO+10%EG+80%M199+0.25 mol/L Sucrose。

1.2.2 预平衡液

预平衡液 1：M199+0.25 mol/L Sucrose。

预平衡液2：各组玻璃化冷冻保护液中DMSO、EG浓度的一半，M199及蔗糖浓度不变。

解冻液：M199+蔗糖梯度浓度（0.5、0.25、0 mol/L）。

1.2.3 成熟液

“其实将石头雕成孔明灯，还不算难，难的是，他们在牡丹花的不同花瓣间，都凿出了暗道，暗道里藏下由万花谷里采摘来的花瓣，这样随着热气的萦绕，不同的暗道发出不同的声响，落下不同的花瓣，至于声音如何混杂在一起，发出不同的声调，花瓣又如何调和，产生不同的气味，这个就不是我能想出来的了。”

M199+10%FBS+100 μg/mLFSH+10 μg/mL LH+200 ng/mL IGF-I+0.11 mg/mL sodium pyruvate+10 μL/mL ITS+25 mg/mL gentamycin。

1.3 试验方法

1.3.1 卵母细胞的收集：该试验参考赵高平等采用切割法收集卵母细胞，具体操作为把处理好的卵巢放入盛有割卵液的直径为10 cm的玻璃培养皿中，先用手术刀划破卵巢表面的卵泡，使其中的卵泡液流入玻璃皿中，再用小匙刮卵泡壁，并用割卵液冲洗卵泡壁和小匙。

1.3.2 卵母细胞的玻璃化冷冻

1.3.2.1 细管法（staw）的冷冻与解冻

细管法的冷冻：GV期驴卵母细胞经过2步预平衡处理后分为五段式装管，分别依次吸入0.5 cm Sucrose、0.5 cm空气、1 cm含有GV期驴卵母细胞的冷冻保护液、0.5 cm空气、0.5 cm Sucrose，热钳封口后直接投入液氮中保存。

细管法的解冻：将冻存2周以上的含驴卵母细胞麦管取出后，在空气中停留15 s左右，再放入37℃的水浴锅中轻轻振荡15 s左右，拿出后擦拭去表面的水分，剪去两端后用移液器将含卵母细胞的内容物吹入37℃含0.5 mol/L蔗糖的解冻液中，10 min中后，将卵母细胞移入37℃含0.25 mol/L蔗糖的解冻液平衡10 min，最后，将卵母细胞移入37℃含0 mol/L蔗糖的解冻液平衡10 min，洗卵液洗涤2～3次，放入成熟液中培养。

1.3.2.2 开放式拉长塑料细管（OPS）冷冻和解冻：开放式拉长塑料细管（OPS）冷冻：GV期驴卵母细胞经过2步预平衡处理后，将OPS管的末端浸入含卵母细胞的冷冻保护液中，利用虹吸作用吸入卵母细胞，每次吸入5～8 μL液体，每次吸入5～7个卵母细胞，然后迅速投入液氮中保存。

1.3.2.3 开放式毛细玻璃管法（GMP）的冷冻和解冻：开放式毛细玻璃管法（GMP）的冷冻和解冻的步骤与OPS的相同。

1.3.3 不同浓度冷冻保护液对驴卵母细胞成熟率的影响：将采集的卵母细胞随机分为5组，分别为正常组、冷冻组Ⅰ、冷冻组Ⅱ、冷冻组Ⅲ、冷冻组Ⅳ。其中，正常组直接进行体外成熟培养，作为对照组；另外4组分别用冷冻保护液Ⅰ、冷冻保护液Ⅱ、冷冻保护液Ⅲ、冷冻保护液Ⅳ进行冷冻，采用OPS管法冷冻，解冻后进行体外成熟培养，30～32 h后统计其成熟情况，每组试验进行3次。

1.3.4 不同冷冻载体驴卵母细胞成熟率的影响：将采集到的卵母细胞随机分为3组，分别用普通玻璃细管、GMP管、OPS管进行冷冻，所用的冷冻保护液为冷冻保护液Ⅱ，解冻后进行体外成熟培养，30～32 h后统计其成熟情况，每组试验进行3次。

1.4 数据分析 试验数据采用卡方检验进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同浓度冷冻保护液对驴卵母细胞成熟率的影响 该试验采用了4种不同配比的冷冻保护液对GV期驴卵母细胞进行冷冻，解冻后对卵母细胞进行成熟培养，结果如表1所示。由表1可以看出，其中冷冻保护液Ⅱ的卵母细胞成熟率 （28.13%）显著（P＜0.05）高于其他 3组的成熟率，但都显著（P＜0.05）低于对照组，说明冷冻对卵母细胞的成熟率有影响，其中冷冻保护液Ⅱ的驴卵母细胞成熟率优于其他3组。

2.2 不同冷冻载体对驴卵母细胞成熟率的影响选用普通玻璃细管、OPS管、GMP管作为冷冻载体，冷冻GV期的驴卵母细胞，解冻后卵母细胞成熟率统计如表2。表2数据显示用该3种冷冻载体冷冻驴卵母细胞时，OPS管组卵母细胞成熟率（28.13%）显著 （P＜0.05）高于普通玻璃细管组（11.67%），与 GMP 管组（23.53%）差异不显著（P＞0.05）。

表1 不同浓度冷冻保护液的驴卵母细胞成熟率

表2 不同冷冻载体对驴卵母细胞成熟率的影响

3 讨论

冷冻保护剂的选择是决定卵母细胞冷冻成功与否的关键因素，冷冻保护剂种类与浓度的不同对卵母细胞的冷冻效果有着重要影响［3］。因此对于低温耐受性较差的卵母细胞来说，选择合适的冷冻保护剂种类、浓度及组合是试验成功与否的关键。许多学者指出，冷冻保护剂的联合使用效果明显优于单一冷冻保护剂［4］。一些研究者指出玻璃化冷冻过程中添加DMSO是必须的，DMSO有助于纺锤体的聚集，并可提高卵母细胞的存活率及成熟率［5］，与乙二醇配合使用可以有效防止解冻时出现“脱玻璃化”现象的产生［6］。李国浩等通过冷冻成熟的牛卵母细胞得出冷冻保护液中加入10%DMSO+10%EG卵裂率及囊胚率最高［7］，而栗颖华通过冷冻未成熟卵母细胞却得出20%DMSO+20%EG 会获得较高的成熟率［8］，说明不同时期的卵母细胞所需的冷冻保护液的浓度差异较大。该试验选取驴GV期的卵母细胞作为冷冻对象，设计了4组冷冻保护液，通过卵母细胞的成熟率来反映冷冻效果的好坏，试验结果证明，20%DMSO+20%EG+60%M199+0.25 mol/L Sucrose的组合冷冻效果最好。

随着科技水平的提高，应用于卵母细胞的冷冻载体也越来越多，如电子显微镜铜网法［9］、开放式拉长塑料细管法（OPS）［10］、毛细玻璃管、固体表面法（SSV）［11］等，这些方法所要达到的目的是尽量缩减冷冻保护液的体积从而使其具有更快的降温速率。该试验选用了3种冷冻卵母细胞的载体，普通玻璃细管由于降温速率较慢，形成玻璃化的效果较差且操作过于复杂，不但在冷冻效果方面不如其他2种冷冻载体，而且由于对操作者有着较高的要求而不适宜大规模应用。GMP管法操作简单，解冻后卵母细胞成熟率和OPS管无显著差异，但由于GMP管是玻璃管，在投入液氮中容易断裂造成卵母细胞丢失而造成浪费，所以OPS管为最适合的冷冻载体。而GMP管和OPS管一个共同的缺点是它们都是开口的，这就要求操作者要对这2种冷冻载体进行充分的消毒，且在液氮无污染的情况下才能保证试验顺利完成。总而言之，不同配比冷冻保护剂及不同的冷冻载体都会对卵母细胞的冷冻效果产生一定的影响，选择适当的冷冻保护剂和冷冻载体都是必要的。

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Effect of Different Vitrificated Cryopreservation Solutions and Loading Devices on in vitro Maturation Rate of Donkey Oocytes

DU Xing-yu1，2，WANG Yan-ni1，2，ZHANG Yan-ru1，2，CAO Jun-wei1，2
（1.College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Inner Mongolia Biological Manufacturing Key Laboratory，Hohhot 010018，China）

The aim of the present study was to evaluate the effect of different vitrificated cryopreservation solutions and loading devices on in vitro maturation rate of donkey oocytes.Four concentration gradient of solutions （Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ）and 3 sets of loading devices were included in this study.The GV-stage oocytes of donkey were cryopreserved by using different solutions and loading devices and were subsequently matured in vitro after thawing.The maturation rate of donkey oocytes was served as an index to compare their performance in cryopreservation.The results demonstrated that the maturation rate of oocytes cryopreserved by solutionⅡ （28.13%）was significantly higher than that of oocytes cryopreserved by the other 3 solutions （P＜0.05）,but was significantly lower than that of oocytes in control （51.77%，P＜0.05）.The maturation rate of oocytes cryopreserved by OPS （28.13%） was significantly higher than that of oocytes cryopreserved by ordinary glass straws（11.67%，P＜0.05）,but was not significant different compared with that of oocytes cryopreserved by GMP（23.53%，P＞0.05）.

donkey；vitrificated cryopreservation；oocytes；maturation rate；loading devices

S822.3

A文章顺序编号1672-5190（2016）03-0004-03

2016-03-13

项目来源：国家自然科学基金（31460292）。

杜兴雨（1990—），男，硕士研究生，主要研究方向为动物遗传育种。

曹俊伟（1970—），男，副教授，博士，硕士生导师，主要研究方向为动物遗传育种。

（责任编辑：钱英红）