李晓华，刘春迎，张科强，吕　哲，陈　岩，倪晓凤，高海成*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.公主岭市范家屯第三医院；3.吉林大学药学院)



芦丁对高糖诱导心肌细胞中tTG表达的调控作用

李晓华1，刘春迎2，张科强1，吕哲3，陈岩3，倪晓凤3，高海成3*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.公主岭市范家屯第三医院；3.吉林大学药学院)

糖尿病性心肌病(DCM)在代谢紊乱及微血管病变的基础上可引发心肌灶性坏死，出现心功能异常，导致心力衰竭、心律失常以及心源性休克，甚至猝死[1，2]。组织转谷氨酰胺酶(tTG)为转谷氨酰胺酶家族的成员，它是钙离子的依赖剂[3]。据报道，tTG存在于各种组织器官中，可在各组织中发挥重要的调控作用[4]。芦丁作为黄酮类单体，已在市场上应用多年，那么其是否可调控tTG的表达，进而对DCM起到防治作用。本实验将从细胞角度探究芦丁对高糖诱导的心肌细胞中tTG表达的调控作用，进而为临床诊断和治疗DCM提供宝贵的意见。

1　材料和方法

1.1大鼠心肌细胞的培养

用大鼠心肌细胞原代培养于含10%小牛血清的高糖DMEM培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长至90%以上时传代。

1.2流式细胞术

细胞培养 48h后，消化、收集细胞，每管细胞数为3×104，冷PBS洗2次，75%冰乙醇固定，摇匀、吹打，4℃保存过夜，用于细胞周期检测。

1.3ELISA方法

各组培养孔中的上清液，按tTGELISA检测试剂盒说明严格操作，显色后，在酶标仪上、用波长 405-650nm间读取数值。

1.4实时PCR方法

Trizol法提取总RNA,进行反转录。实时定量PCR反应体系20μl。反应条件为:95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s,共30个循环。tTG: 5′-AAGGGAAGTCTTCACCAGAGCCAA-3′和 5′-CGATGTGGGCAAACACGTCAAAGT-3′。

1.5Westernblot方法

加入组织蛋白裂解液,研磨,4℃、12 000r/min离心20min，测定上清液蛋白质浓度。经SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜，加入抗tTG及β-actin抗体,4℃过夜,加入二抗,37℃孵育2h，ECL试剂显色。

1.6统计学方法

采用SPSS11.5 软件统计，应用单因素方差分析(One-WayANOVA) 进行处理，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1芦丁对大鼠心肌细胞周期的影响

由图1可见，正常心肌细胞数为63.3%，B3区为61.1%；高糖刺激后心肌细胞数61.7%，B3区为61.6%。给予阳性药和罗布麻提取物芦丁后，其细胞数分别是65.04%和63.46%，B3区为87.7%和78.4%。

图1　芦丁对心肌细胞周期的影响

2.2ELISA测定心肌细胞上清液中FN和Col-I的含量

高糖诱导后，FN和Col-I的蛋白表达量有所增加(P< 0.05)；而给予阳性药和芦丁后，FN和Col-I表达量降低(P< 0.05)，说明芦丁抑制了FN和Col-I胶原蛋白的表达，见表1。

表1　细胞上清液中FN 和 Col-I的含量(ng/ml)

*P<0.05vscontrol,△P<0.05vsmodel.

2.3心肌细胞上清液中tTG的基因表达

给予高糖后，tTG的基因表达量增加，说明高糖诱导心肌细胞损伤时，tTG参与了损伤的发生过程；注射阳性药和芦丁后，tTG的表达量降低(P<0.05)，抑制了tTG基因表达，见图2。

2.4Westernblot测定心肌细胞上清夜中tTG的含量

高糖诱导后，tTG的蛋白表达量有所增加(P<0.05)；而给予阳性药和芦丁后，tTG表达量降低(P< 0.05)，说明芦丁抑制了tTG胶原蛋白的表达，见图3。

图2各组心肌细胞上清液中tTG基因表达

图3各组心肌细胞上清液中tTG的蛋白表达

3　讨论

糖尿病(DM)为慢性代谢性、内分泌失调性疾病，其并发症包括眼、脑、心、肾以及血管等[5]。1974年，DCM被Hamby等[6]提出后，便引起科研人员的广泛重视，其特点为心力衰竭发生率较高。DCM的发病是由糖脂代谢紊乱、细胞因子以及生长因子表达或活性增加等多种因素综合作用的结果[7]。近年来，tTG在组织器官纤维化中的作用已备受关注。它属于转谷氨酰胺酶家族，它能催化细胞外基质蛋白(谷氨酰胺残基与赖氨酸残基间的转谷氨酰胺)反应，它可使纤维连接蛋白、胶原纤维、层粘连蛋白等发生交联，形成稳固结构而抵抗基质金属蛋白酶的降解，是器官纤维化发生的重要因子[4]。研究证实[8]，糖尿病大鼠肾脏组织中tTG的蛋白活性及其交联产物的水平均明显增高。芦丁作为黄酮类药物，广泛应用于临床，其含量占总黄酮的70%-90%。芦丁的又名芸香甙、维生素P，其具有降低毛细血管脆性，改善微循环的作用。在临床上，其主要用于糖尿病、高血压、高血糖等辅助治疗作用。在本研究中，流式细胞术结果显示，芦丁对细胞的周期有调控作用；高糖诱导的心肌细胞中tTG的蛋白和mRNA表达明显增加，而芦丁干预后其表达降低。

[1]WangK,HanD,ZhangY,etal.Protectiveeffectandmechanismofβ-CM7onreninangiotensinsystem&diabeticcardiomyopathy[J].ShengWuGongChengXueBao,2016,32(2):195.

[2]TorellaD,EllisonGM,TorellaM,etal.Carbonicanhydraseactivationisassociatedwithworsenedpathologicalremodelinginhumanischemicdiabeticcardiomyopathy[J].JAmHeartAssoc,2014,3(2):e000434.

[3]MunsieL,CaronN,AtwalRS,etal.Mutanthuntingtincausesdefectiveactinremodelingduringstress:defininganewrolefortransglutaminase2inneurodegenerativedisease[J].HumMolGenet,2011,20(10):1937.

[4]GaoHC,ZhuK,GaoHM,etal.Roleoftissuetransglutaminaseinthepathogenesisofdiabeticcardiomyopathyandtheinterventioneffectofrutin[J].ExpTherMed,2015,9(4):1103.

[5]QuilliotD,WaltersE,BonteJP,etal.Diabetesmellitusworsensantioxidantstatusinpatientswithchronicpancreatitis[J].AmJClinNutr,2005,81(5):1117.

[6]HambyRI,ZoneraichS,ShermanL.Diabeticcardiomyopathy[J].JAMA,1974,229(13):1749.

[7]简春燕,吴铿.糖尿病性心肌病发病机制和治疗的研究现状[J].中华临床医师杂志,2012,6(1) :164.

[8]刘森炎,黄海长,李晓玫.组织型转谷氨酰胺酶与肾脏纤维化[J].生理科学进展,2005,36(4):314.

吉林省科技厅项目(3D515BR83432)；吉林大学共青团项目(451160306038)

1007-4287(2016)09-1445-02

2015-08-02)