周玄博，冯　虎，金　鹏，胡媛媛，李　宁，陈玉丙*

(吉林大学第二医院 1.胸外科；2.放疗科，吉林 长春130041)



非小细胞肺癌患者血清外泌体的分离与鉴定

周玄博1，冯虎2，金鹏2，胡媛媛2，李宁2，陈玉丙2*

(吉林大学第二医院 1.胸外科；2.放疗科，吉林 长春130041)

外泌体最初是由Johnstone等在哺乳动物网织红细胞研究中发现并命名[1-6]。后来的研究发现，外泌体在细胞内形成小囊泡，可以通过胞吐释放到周围环境中，并能够在血液、尿液等多种体液中检测到[7]。外泌体中携带着它本身来源的细胞的多种成分，如蛋白质、DNA、RNA、脂质等[8]。因此，建立稳定的外泌体分离方法是外泌体以及后续相关研究的前提。超速离心分离外泌体的方法是当前外泌体分离的金标准。本研究利用超速离心的方法分离并鉴定非小细胞肺癌患者血清中的外泌体，同时也为研究非小细胞肺癌的发生、发展以及早期筛查提供新的切入点。

1　材料与方法

1.1材料

BCA蛋白浓度测定试剂盒(博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所)；兔抗CD9、CD63单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗兔二抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；ECL化学发光液(上海七海复泰生物科技有限公司)；高速离心机、超速离心机(美国Beckman公司)；透射电子显微镜(美国FET公司)；微孔板分光光度仪(美国BioTek公司)；凝胶成像系统(Image Quant LAS4010)。

1.2方法

1.2.1收集血清获得非小细胞肺癌患者的知情同意后，从患者外周静脉血取5 ml，室温静置30 min后，4℃、 1000×g离心10分钟，取上层血清1 ml装于1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2外泌体的提取取1 ml上述血清至10 ml一次性离心管中，加9 ml 1×PBS液稀释，上下颠倒混匀，以4℃、2 000×g的条件离心30分钟。将上清转移到干净的超速离心管中，以4℃、12 000×g的条件离心45分钟。将上清转移到干净的超速离心管中，以4℃、110 000×g的条件离心2小时，弃掉上清。用9 ml PBS液重悬沉淀，用0.22 μm滤器过滤上述重悬液，滤液转移到另一个干净的超速离心管。以4℃、110 000×g的条件离心70分钟，弃掉上清液。用500 μl PBS液重悬沉淀转移到1.5 ml EP管中，-80℃保存。

1.2.3蛋白定量将0.5 mg /mL 的蛋白标准品按0，1，2，4，8，12， 16，20 μl顺序加到96孔板中，各孔加入PBS 补充到20 μl；外泌体蛋白样品取1μl加到96孔板中，加PBS补足到20 μl；各孔加入200 μl BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀，37℃孵育45 min后放入酶标仪，于595 nm 波长测定各孔吸光度。

1.2.4外泌体的鉴定

1.2.4.1外泌体形态的观察取一干净的100目载样铜网置于封口膜上，将新鲜得到的外泌体溶液20 μl用等体积PBS稀释后滴加到铜网上，室温静置1分钟，室温晾干。然后用3%(w/v)磷钨酸钠溶液20 μl滴到铜网上负染，1分钟后用滤纸将多余液体轻轻吸去。将铜网放到透射电镜下观察，照相。

1.2.4.2外泌体表面特异性分子标志的检测取上述分离得到的外泌体500 μl，加入100 μl细胞裂解液，将混合物依次放入-80℃、37℃反复冻融三次1 h。BCA 法进行蛋白定量。将蛋白与5×SDS上样缓冲液混匀(体积比4∶1)，煮10 min,12 000转/min离心10 min。每孔加入10 μg蛋白的样品上样至15%的SDS聚丙烯凝胶中电泳，然后转印至PVDF 膜上。5% 脱脂牛奶封闭，按预染Marker 标记的分子量剪裁转印膜，分别加入兔抗人CD63、CD9单克隆抗体(1∶700 ) ，4℃摇床上过夜。TBST (10 mmol /L Tris，pH 7.4，150 mmol /L NaCl和0.1%Tween 20) 洗涤3 次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST 洗涤3 次后ECL 法显色，凝胶图像分析系统照相。

2　结果

2.1外泌体的形态

从非小细胞肺癌患者血清中提取到一些泡状物，透射电镜下观察可见其大小较为均一，形态呈杯口状，直径30-120 nm，有完整膜，内有低电子密度小颗粒。见图1。

2.2外泌体特异性分子标志物的表达

从非小细胞肺癌患者血清中提取的囊泡表达了外泌体特异性分子标志物CD63 和CD9，进一步证明了该泡状物可能为外泌体。见图2。

图1　非小细胞肺癌血清来源外泌体的形态

图2　非小细胞肺癌血清来源外泌体表面标志蛋白的表达

3　讨论

外泌体是一种细胞来源的小囊泡，大小30-120 nm，几乎存在于所有的生物体液中。外泌体能够稳定表达某些能够参与抗原递呈的蛋白质，如CD63、CD9及TSG101等[9-12]。外泌体上携带了多种其来源细胞的生物大分子，如蛋白质、RNA、质脂，能够揭示其来源细胞的分子指纹和细胞状态[13]。同时研究表明，外泌体的组成和功能与其来源的细胞是有关的[14]。

许多细胞在正常和病理情况下都可以分泌外泌体。他们可以运载一些预示着病理生理状态的核酸和蛋白，其对临床诊断标记物的发现有着重要的作用。许多的研究表明外泌体中包含与肿瘤、神经组织退化、新陈代谢、感染以及其他疾病相关的核酸和蛋白[15-17]。2009年 Rabinowits等完成了一个关于肺腺癌的研究，这一研究比较了肺腺癌患者和对照组人群中的肿瘤来源外泌体的循环水平、外泌体小RNA、特异性外泌体miRNA的表达水平，他们发现了循环外泌体和肺腺癌活检样品中miRNA的表达是相似的，而对照组却有着显著的不同。这也就暗示了循环外泌体miRNA在肺腺癌筛查检测中可能会发挥重要的作用[18]。Tanaka等报道了食管鳞状细胞癌患者血清外泌体miR-21的表达水平比良性肿瘤无全身感染患者中要高。而且，外泌体miR-21与肿瘤进展和侵袭性是及其相关的。总之，越来越多的发现表明外泌体可以成为许多疾病的一种可能性的生物标志，为疾病基因的靶向治疗提供依据。

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。目前外泌体分离提取的方法有超速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉底法、试剂盒提取等。超离法具有操作简单，获得的囊泡数量较多的优点，因此，超速离心成为了研究者最常用的外泌体分离纯化的手段，是目前外泌体分离纯化的金标准。但是不可否认，超速离心的方法过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑。

本研究利用超速离心法从非小细胞肺癌患者血清中分离得到大小较为均一内含电子致密物的泡状物，透射电镜观察其形态，通过 Western blot技术分析泡状物的外泌体特异性分子标记的表达，证实了该泡状物为外泌体。超速离心法、Western blot以及透射电镜技术的综合运用建立了稳定分离鉴定血清外泌体的方法。

综上所述，本研究证实了非小细胞肺癌患者血清中存在外泌体，并建立了一套稳定分离鉴定血清外泌体的方法。为进行大样本血清外泌体蛋白、核酸检测以及非小细胞肺癌的发生、发展以及早期筛查研究奠定基础。

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吉林省自然科学基金资助项目(20160101104JC)

1007-4287(2016)09-1439-03

2015-10-17)