吴鹏飞，谷文光，戴志唐*

(1.淮安市第一人民医院 骨科，江苏 淮安223300；2.哈尔滨医科大学附属第一临床医院 外科，黑龙江 哈尔滨150001)



Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶复合材料对兔半月板损伤修复作用的实验研究

吴鹏飞1，谷文光2，戴志唐1*

(1.淮安市第一人民医院 骨科，江苏 淮安223300；2.哈尔滨医科大学附属第一临床医院 外科，黑龙江 哈尔滨150001)

目的探讨Ⅰ型胶原-转化生长因子-β1(Transform growth factor，TGF-β1)-纤维蛋白胶复合材料修复兔半月板无血运区损伤的临床效果。方法选取健康新西兰大白兔60只，在半月板损伤造模的基础上随机分为损伤对照组(A组)、TGF-β1组(B组)、Ⅰ型胶原-纤维蛋白胶组(C组)和Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶组(D组)。A组不做处理， C组与D组于关节腔内分别一次性注入Ⅰ型胶原-生物蛋白胶复合物、Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶复合材料至填充物与半月板表面相平为止；B组于关节腔内连续注射3周TGF-β1。术后2周、4周、12周分批处死动物，进行形态学观察和组织学检查。结果形态学观察发现，损伤后各组新西兰大白兔的半月板组织形态变小，颜色微黄，质地较硬，脆性增加。组织学检查发现，B组对半月板无血运区损伤的愈合无明显影响，仅对半月板边缘滑膜中的成纤维细胞有明显的促进作用；C组半月板伤口较术前小，表面稍凹陷，愈合组织与邻近半月板组织结合紧密；D组半月板表现为纤维软骨样愈合，但愈合部分与正常半月板仍有差异。A组、B组、C组，在4周、12周时与D组愈合情况比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用Ⅰ型胶原-TGF-β1-生物蛋白胶复合材料对半月板无血运区损伤治疗是非缝合技术治疗半月板损伤的一种可靠手段。

半月板；Ⅰ型胶原；转化生长因子-β1；纤维蛋白胶

(ChinJLabDiagn,2016,20:1436)

膝关节半月板损伤是一种常见的运动损伤，因半月板的血供特点而使半月板损伤成为临床治疗修复的难题。近年来，临床上对与半月板的修复方法研究取得了飞跃式的进展，出现了一系列革命式的修复半月板技术和生物材料，但却被半月板缝合严格苛刻的手术适应症所禁锢[3-6]。半月板损伤缝合治疗对发生在半月板外1/3血供区损伤的治疗效果满意，但对半月板红白区或白区的损伤即使勉强能够缝合，却因血供影响而致愈合能力差。目前，生长因子和组织工程学研究给半月板修复和移植带来新的希望，使半月板损伤后修复和移植成为可能。本实验通过验证一种细胞因子-转化生子因子-β1(TGF-β1)与半月板愈合过程中的关联性，探讨TGF-β1复合材料对兔半月板损伤的修复作用。

1　材料和方法

1.1材料

实验动物：新西兰大白兔60只；雌雄不限，体重 2.0-2.5 kg，由哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验室提供。实验材料：TGF-β1(sigma公司)；Ⅰ型胶原(sigma 公司)；生物蛋白胶(北京正清然有限公司)。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶的制备Ⅰ型胶原粉剂称重，由生物蛋白胶溶解配成3 mg/L纤维蛋白胶-Ⅰ型胶原复合物；将5 ng TGF-β1离心，用柠檬酸稀释，再加冻存液分别配成25 mg/L的TGF-β1，用时用移液枪头取出，并与纤维蛋白胶-Ⅰ型胶原复合物混匀即可使用。所有配置的混合物都是即用即配。

1.2.2动物实验选取健康新西兰大白兔60只，随机分为损伤对照组(A组)、TGF-β1组(B组)、Ⅰ型胶原-纤维蛋白胶组(C组)和Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶组(D组)。用2%戊巴比妥钠(2 mg/kg)静脉全麻，取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，用自制的半月板拉钩显露内侧半月板前角、体部及股骨髁软骨面；用镰状刀片于内侧半月板前角和体部中央略靠近半月板的边缘做一个长0.5 cm、宽0.2 cm的全层裂伤。然后将Ⅰ型胶原-生物蛋白胶复合物、Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶复合材料一次性注入裂口，至填充物与半月板表面相平为止；TGF-β1组于关节腔内连续注射3周TGF-β1；A组不做任何处理。术后给予抗生素头孢唑林钠0.5 g肌肉注射，并于术后第一日仍给予肌注抗生素，并添加蔬菜等副食增强抵抗力。分别于术后2周、4周、12周处死动物，每组每个时间点5只10个半月板，行大体及形态学观察和病理切片。

1.3观察指标

将半月板标本进行大体形态观察后，再置入体积分数为10%甲醛溶液中固定1-3 d，然后进行脱水、石蜡包埋，标本采用苏木精-伊红染色，光学显微镜检查。

2　结果

2.1形态学观察

除1只外，其他新西兰大白兔手术侧膝关节均无切口感染和关节积液，无半月板与关节面软骨粘连；仅C组有1例半月板术后出现关节粘连内外侧半月板消失，关节强直，股骨髁面、胫骨面关节面粗糙，成颗粒状，软骨破坏。A组、B组半月板裂口均未愈合、未见组织填充；C组半月板部分组织充填；D组全部半月板伤口均已被组织填充。2周时，A组、B组愈合0个、C组愈合1个、D组愈合1个，提示由于时间短，未达到临床愈合时间。4周时，A组、B组、C组分别愈合0个、1个、1个，与D组愈合6个比较，差异有统计学意义(P<0.05)；12周时，A组、B组、C组分别愈合0个、3个、3个，与D组愈合8个比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但愈合组织的颜色较正常半月板组织微黄，整体形态变小，裂口较术前变窄，其表面稍向内陷，愈合组织与邻近半月板组织粘连紧密。

2.2组织学检查

A组：术后2-12周共观察半月板30个，各观察期裂口均未见愈合，细胞排列紊乱，大量瘢痕增生，损伤边缘无成纤维细胞和软骨细胞增殖，见图1。

B组：观察12周半月板始终未见纤维软骨样增生，仅边缘滑膜中成纤维细胞、滑膜细胞明显增生，血管也见增生，见图2。

C组：4周时缺损大部分被幼稚软骨样结构所充填，缺损底部软骨细胞肥大，有少量骨小梁及血窦形成，缺损范围缩小；8周时软骨下骨形成活跃；12周时缺损区接近正常软骨，软骨细胞散在排列，见图3。

D组：术后2周见缺损为红色的胶原蛋白组织填充，充满整个缺损区，亦可见少量成纤维细胞样细胞；术后4周，镜下见缺损内被胶原纤维组织填充，成纤维细胞为其主要的细胞成分；术后12周，所有缺损均被纤维软骨样组织填充。可见软骨细胞特有的软骨陷窝及软骨囊，但修复的组织与邻近的正常半月板组织仍存在差异，愈合组织中仍可见成纤维细胞样细胞，见图4。

图112周，损伤处半月板纤维软骨细胞基本消失，不规则纤维成分增生、瘢痕化

图212周，生物蛋白胶组半月板细胞不规则散落在纤维组织中，增生的组织吞没了半月板细胞

图34周，滑膜细胞、成纤维细胞增生，未见纤维软骨样细胞

图412周纤维软骨细胞明显增多，软骨周围成纤维细胞增生，软骨细胞呈束状排列

3　讨论

半月板的解剖特点为半月板红区具有血液供应，该部分具有愈合能力，其余区域愈合能力较差。但临床上多数医生无法对半月板是否在“红区”或“白区”的撕裂作出定位诊断，因此，一旦发生损伤，应尽量修复损伤的半月板，而不是放弃愈合的机会。本文探索半月板损伤后愈合所需的条件，试验中损伤对照组自始至终都表现为半月板未愈合，与文献报道相符，提示半月板无血运区的损伤很难自然愈合[6,7]。本研究发现，TGF-β1组、Ⅰ型胶原-纤维蛋白胶组和Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶组在4周、12周时表现出与对照组不同程度的愈合。在半月板无血运区损伤后4周，裂伤边缘有少量正常半月板组织的同源细胞群。不能产生愈合的原因可能是因为进入分裂状态的细胞数少、所需营养不足，起不到有效作用所致。因此，笔者认为半月板无血运区损伤不能自然愈合，但是可以通过改变外部条件来促使其愈合。本研究所用的Ⅰ型胶原-生物蛋白胶和Ⅰ型胶原-TGF-β1-生物蛋白胶复合物促进了半月板的愈合，印证了前述假设。

Ⅰ型胶原是一种含糖蛋白质，近年来Ⅰ型胶原作为一种生物性载体其应用逐渐增多。以胶原为基质修复关节软骨，因胶原凝胶的强度差，修复软骨缺损达不到力学强度，有实验研究发现胶原在高压强度下4周左右就被完全破损降解，而纤维蛋白胶比Ⅰ型胶原具有良好的机械性和可塑性，利用纤维蛋白胶可以降低Ⅰ型胶原的降解速度和增加胶原的机械强度[8-11]。外源性纤维蛋白胶在半月板无血管区损伤愈合中成功地起到一种支架作用，借助这种支架，纤维软骨细胞可长入其中，并不断增生分化，分泌合成胶原基质，之后纤维蛋白逐渐降解，而代之以纤维软骨细胞合成的胶原基质，形成一个完整的半月板原位修复过程。由于修复半月板的主质细胞是纤维软骨修复，而并非以纤维修复为特征的瘢痕修复，使得临床上以半月板原位修复代替半月板切除术治疗半月板损伤成为可能。本研究Ⅰ型胶原-生物蛋白胶组在4周、12周时有部分半月板愈合的表现，提示损伤处的充填物起到了支架作用，促使惰性的半月板纤维软骨细胞增殖、分化。

TGF-β主要通过两种途径促进缺损的修复：一方面发挥软骨诱导作用，促进干细胞分化为软骨；另一方面，促进软骨特异性基质的合成。大量体外研究证实，适当浓度的TGF-β1具有促进半月板纤维软骨细胞增殖的作用。本文Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶复合物可增强TGF-β1的生物学活性，其实验结果比单用Ⅰ型胶原-生物蛋白胶或TGF-β1的结果要好，可形成纤维软骨样愈合。单独应用TGF-β1治疗半月板损伤发现对无血运区半月板的损伤愈合无明显影响，考虑主要是因为TGF-β在体外作用时间短，体外实验的要求苛刻，体内实验不能完全模拟，且TGF-β在体内容易被吸收、稀释、降解、半月板创口内无桥架材料以及TGF-β1无保护剂型和载体，因此，体外实验利用TGF-β1对半月板愈合无影响。半月板损伤后，半月板的新陈代谢发生变化，很多复杂因素相互作用影响半月板愈合，如存在白细胞介素1(IL-1)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)，内在的半月板修复在体外显着抑制，而合成代谢的生长因子，如转化生长因子-β1(TGF-β1)，虽然加强半月板修复，他们不能完全克服维护IL-1介导的抑制[12]。

膝关节半月板损伤是一种常见的运动损伤，因半月板的血供特点使半月板损伤成为临床上治疗修复的难题。本文验证了转化生子因子-β1与半月板愈合过程中的关联性，采用Ⅰ型胶原-TGF-β1-生物蛋白胶复合材料对半月板无血运区损伤治疗是非缝合技术治疗半月板损伤一种可靠的治疗手段。

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Experimental study on the effect of collagen type -TGF- I beta 1- fibrin sealant on the repair of meniscus injury in rabbits

WUPeng-fei,GUWen-guang，DAIZhi-tang.

(Departmentoforthopedics,Huai'anFirstPeople'sHospital,Huaian223300,China)

ObjectiveTo explore the type I collagen-transforming growth factor-β1 (Transform growth factor of TGF-β1) - fibrin glue composite repair rabbit meniscus injury effect of avascular zone.MethodsHealthy New Zealand white rabbits 60,the first unified damage model avascular zone in rabbits meniscus.Randomly divided into control group,TGF-β1 group,type I collagen-the fibrin glue group,and collagen type I-TGF-β1 in-fiber protein glue group.Control group did not deal with.Type I collagen fibrin glue complex,type-TGF-collagen I beta 1-fibrin glue composite material one-time injection gap,to the filler and the surface of the meniscus so far;TGF-beta 1 group of joint cavity for three weeks of continuous injection.2 weeks,4 weeks,12 weeks after surgery,respectively,were sacrificed animals,mainly for the observation of gross morphology and histological examination.ResultsMorphologically,the morphology of the meniscus of New Zealand white rabbits was smaller,and the color of New Zealand white rabbits was slightly yellow,and the texture was hard and brittle.Histological examination,B group of avascular area damage healing without obvious effect,only the synovial membrane at the edge of the meniscus into fiber cells have a significant role in promoting; meniscus wound in group C compared with preoperative small surface is slightly concave,healing tissue and adjacent meniscus tissue closely; group D meniscus showed fibrous cartilage healing,but partially healed with normal meniscus still has the difference.A,B,C group,in 4 weeks,12 weeks,compared with the D group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionCollagen type I-TGF-β1 in-fibrin glue composite materials for the treatment of meniscus injury in the non blood circulation area is a reliable treatment method for the treatment of meniscus injury.

Menisci；the type I collagen；transforming growth factor-β1；fibrin glue

国家自然科学基金(81472512)

1007-4287(2016)09-1436-04

R684

A

2015-05-06)