刘鸿飞　肖琬莉　张　涛　张　强　田黎明　闫冬梅　葛堂栋　王明富

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江　佳木斯　154002)



PTD4-凋亡素融合蛋白对 Hela细胞 bak 基因表达的影响

刘鸿飞肖琬莉张涛张强田黎明闫冬梅葛堂栋王明富

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154002)

目的研究PTD4-凋亡素(apoptin)融合蛋白对Hela细胞bak基因表达的影响。方法原核表达系统表达PTD4-apoptin融合蛋白，使用CCK8试剂盒检测融合蛋白对Hela细胞的抑制作用；PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela细胞24 h后，提取细胞总RNA和总蛋白，采用RT-PCR和Western印迹检测bak基因在RNA水平和蛋白水平的表达。结果PTD4-apoptin融合蛋白诱导Hela细胞bak mRNA和蛋白水平表达量较对照组均显著提高。结论PTD4-apoptin蛋白可诱导Hela细胞凋亡，与bak基因参与凋亡调控相关。

PTD4-apoptin；bak基因；细胞凋亡

凋亡素(apoptin)是鸡贫血病毒编码的一种功能蛋白，可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无毒副作用。apoptin可高效抑制多种肿瘤细胞凋亡，但其诱导肿瘤细胞凋亡的机制仍不明确〔1〕。研究表明，apoptin诱导的细胞凋亡受到线粒体凋亡通路的有效调控〔2〕。bak作为 bcl-2家族中的多结构域促凋亡蛋白，是线粒体外膜通透性改变的关键蛋白质之一〔3〕。本研究通过考察apoptin作用 Hela细胞后 bak 基因表达量的变化，初步探讨 bak 基因与apoptin诱导细胞凋亡作用的相关性。

1　材料与方法

1.1载体和细胞E.coli BL21(DE3)感受态菌购于天根生物科技有限公司，pGEX-6p-1-PTD4-apoptin质粒由本实验室构建，人宫颈癌Hela细胞由哈尔滨医科大学惠赠。

1.2试剂PCR 试剂盒、SDS-PAGE 凝胶试剂盒、蛋白 marker、4倍SDS上样缓冲液、离心超滤浓缩管、PVDF膜购自北京索莱宝生物科技有限公司，RT-PCR试剂盒购于大连宝生物科技有限公司，GST Sefinose TM Resin 购于上海生工生物科技有限公司，bak 一抗、β-actin一抗、二抗购于武汉博士德生物有限公司。

1.3PTD4-apoptin融合蛋白的提取及活性检测

1.3.1PTD4-apoptin融合蛋白的提取使用IPTG 诱导含pGEX-6p-1-PTD4-apoptin质粒的 Ecoli BL21(DE3)菌表达 PTD4-apoptin融合蛋白；收集菌体，PBS 缓冲液重悬菌体，超声破碎，收集上清，0.22 μm滤膜过滤；GST亲和层柱纯化蛋白，使用超滤柱浓缩，更换蛋白缓冲液；用SDS-PAGE 电泳检测蛋白提取效果。

1.3.2PTD4-apoptin融合蛋白的活性检测收集细胞于96孔板，3 000个/孔，培养过夜后，加入 PTD4-apoptin融合蛋白，继续培养48 h后，使用CCK8检测试剂盒测定Hela细胞的生长状况，分析检测结果。以蛋白溶解缓冲液 PBS作为对照。

1.4RT-PCR检测PTD4-apoptin作用后Hela细胞bak mRNA的表达水平收集细胞，trizol 提取 RNA，DU800测定mRNA浓度，使用逆转录试剂盒将bak mRNA逆转录成cDNA并进行PCR扩增，以β-actin作为内参照；bak上游引物：5'-ACGCTATGACTCAGAGTTCC-3'，下游引物：5'-CTTCGTACCACAAACTGGCC-3'。PCR扩增时退火温度为59℃，循环30次，产物长度为360 bp。β-actin上游引物：5'-GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'，下游引物：5'-TGTCACGCACGATTTCCCTCTC-3'，扩增时退火温度62℃，循环30次，产物长度为280 bp。PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，观察并分析结果。

1.5Western印迹检测PTD4-apoptin作用Hela细胞后bak 基因蛋白表达量收集细胞，RIPA 裂解液裂解细胞，收集细胞中的总蛋白，与上样缓冲液混合，沸水浴5 min，SDS-PAGE 电泳分离蛋白条带，将蛋白由聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，使用ECL发光液显色后暗室曝光。以β-actin作为内参照。

1.6统计学方法采用SAS9.1.3软件进行t检验和单因素方差分析。

2　结　果

2.1蛋白表达纯化IPTG诱导后获得目的蛋白，经提取纯化后，SDS-PAGE凝胶电泳检测结果显示，与对照组相比在40 kD附近出现条带。纯化后，在该位置附近出现单一目的条带，表明成功提取纯化出 PTD4-apoptin 融合蛋白。见图1。

2.2PTD4-apoptin 融合蛋白活性检测PTD4-apoptin融合蛋白与Hela细胞孵育后，对Hela细胞的抑制率达93.49%，PTD4-apoptin融合蛋白对Hela细胞具有明显抑制作用，而PBS对照组对Hela细胞并无明显抑制作用(5%)(P>0.05)。

2.3PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela细胞后bak mRNA的表达PTD4-apoptin 融合蛋白处理Hela细胞24 h后，Hela细胞中的bak mRNA表达量明显上调，见图2。单因素方差分析表明PTD4-apoptin融合蛋白处理组与PBS组及空白对照组相比bak mRNA 的表达量差异显著(P<0.001)，PBS组与空白对照组相比bak mRNA表达量无统计学差异(P>0.05)。

2.4PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela细胞后bak蛋白水平的表达PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela细胞后bak表达量显著升高，见图3。单因素方差分析表明PTD4-apoptin融合蛋白处理组与PBS组及空白对照组相比bak表达量差异显著(P<0.001)，PBS组与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)。

M：Marker；1：pGEX-6p-1空载体蛋白;2：pGEX-6p-1-PTD4-apoptin 载体蛋白;3：过柱后蛋白提取液;4：洗柱液;5：蛋白洗脱图1　PTD4-apoptin融合蛋白提取结果

M：Marker；1：PTD4-apoptin 融合蛋白组 2：PBS组 3：空白对照组图2　PTD4-apoptin融合蛋白对Hela细胞bak mRNA的表达

1：PTD4-apoptin 融合蛋白作用组;2：PBS组;3：空白对照组图3　PTD4-apoptin融合蛋白对Hela细胞bak的表达

3　讨　论

有研究发现，apoptin通过上调 p73 基因的 Tap73 亚基的表达，激活 PUMA 基因，诱导线粒体途径释放细胞色素 C 与Caspase3 结合引起凋亡〔4〕，其诱导的肿瘤细胞凋亡作用主要通过线粒体凋亡途径，因此，其受到线粒体凋亡途径的相关基因的有效调控〔5，6〕。在线粒体apoptin途径中，bcl-2 家族成员具有关键作用，但是目前研究表明，抑凋亡基因bcl-2的过表达并不抑制apoptin诱导的肿瘤细胞凋亡〔7〕，apoptin对促凋亡基因 bax 的表达量也无明显影响〔8〕。bax/bak 都属于 bcl-2家族的促凋亡基因，可调控线粒体外膜通透性〔9〕。本研究通过诱导提取获得具有活性的 PTD4-Apoptin 融合蛋白，可显著抑制Hela 细胞生长〔10〕，诱导Hela 细胞bak 基因表达显著提高。结果提示 PTD4-apoptin 诱导肿瘤细胞凋亡，有可能需要通过上调 bak 基因的表达，发挥其促凋亡作用。

1武晓燕,侯玲玲,晏琼,等.凋亡素诱导细胞凋亡的机制及其在肿瘤治疗中的应用〔J〕.生理科学进展，2014；45(1)：45-8.

3梁芙蓉,秦建全,沈晓云.凋亡通路中 Bax 和 Bak 蛋白的激活模型〔J〕.生命的化学,2011;31(6):858-62.

4Taebunpakulm P,Sayan BS,Flinterman M，etal.Apoptin induces apoptosis by changing the equilibrium between the stability of Tap73 and ΔNp73 isoforms through ubiquitin ligase PIR2〔J〕.Apoptosis,2012;17(8):726-76.

5张园，朱惠明，李银鹏，等.凋亡素基因在人肝细胞和肝癌细胞中的定位观察及对线粒体膜电位的影响〔J〕.广东医学，2011;32(18)：2379-81.

6Zhou SN，Zhang MX，Zhang J，etal.Mechanisms of apoptin-induced cell death〔J〕.Med Oncol,2012;29(4):2985-91.

7阮军,缪李丽.凋亡素与肿瘤细胞凋亡的研究进展〔J〕.中国药房，2014；25(1):82-5.

8Li J,Wang HF,Ma Z,etal.TAT-Apoptin induces apoptosis in the human bladder cancer EJ cell line and regulates Bax,Bcl-2,caspase-3 and surviving expression〔J〕.Exp Ther Med,2012;3(6):1033-8.

9吉木斯，李存保.Bcl-2 家族在线粒体细胞凋亡途径中的作用〔J〕.内蒙古医科大学学报，2013； 35(2)：152-7.

10荆鑫鑫，刘鸿飞，张涛，等.PTD4-Apoptin 融合蛋白可溶性表达及其对Hela 细胞的抑制作用〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(10)：5737-9.

〔2016-02-24修回〕

(编辑郭菁)

黑龙江省自然科学基金项目(No.H201360)；黑龙江省教育厅项目(No.12531663)；佳木斯大学重大项目(No.Szp2012-01)；佳木斯大学研究生创新项目(No.LZZ2015_010)

张涛(1964-)，女，教授，硕士生导师，主要从事抗肿瘤药物研究。

刘鸿飞(1989-)，男，在读硕士，主要从事抗肿瘤药物研究。

R737.33

A

1005-9202(2016)18-4419-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.007