周秀云

(北京市海淀区妇幼保健院超声科，北京　100080)



·肿瘤·

多配体蛋白聚糖结合蛋白在女性脑胶质瘤侵袭/转移中的异常表达机制及其影像学规律

周秀云

(北京市海淀区妇幼保健院超声科，北京100080)

目的探讨多配体蛋白聚糖结合蛋白(Syntenin)在女性脑胶质瘤侵袭/转移中的异常表达分子机制并分析其影像学规律。方法选取45例该院收治的经手术证实的女性脑肿瘤患者，其中脑胶质瘤26例，转移瘤19例。取手术切除获得的26份脑胶质瘤组织，采用RT-PCR和免疫印迹技术检测Syntenin和磷酸化FAK Tyr397基因与蛋白的表达情况。收集术前患者行常规MRI和动态增强MRI扫描相关资料，在肿瘤实性区域最大截面和周围区域分别选取3个ROI，经工作站处理并计算得到ROI内的肿瘤的容积转运常数(Ktrans)、回流速率常数(Kep)、血管外细胞容积分数(Ve)。分析脑胶质瘤和转移瘤的影像学规律。结果Syntenin mRNA、FAK mRNA表达水平在不同病理分级的脑胶质瘤中差异均有统计学意义(P<0.05)；Syntenin mRNA、FAK mRNA表达水平与脑胶质瘤病理等级呈正相关。Syntenin 与磷酸化FAK Tyr397蛋白表达水平在不同病理分级的脑胶质瘤中差异均有统计学意义(P<0.05)；Syntenin 与磷酸化FAK Tyr397蛋白表达水平与脑胶质瘤病理等级呈正相关；Syntenin 蛋白表达水平与FAK Tyr397呈正相关。胶质瘤与转移瘤的瘤实质Ktrans、Kep、Ve值之间差异均无统计学意义(P>0.05)。胶角质母细胞瘤周围区域Ktrans、Kep、Ve值均明显高于转移瘤周围区域，差异有统计学意义(P<0.05)。胶质瘤Ktrans值与周围区域Ktrans、Kep、Ve值均呈正相关；脑转移瘤Ktrans值与周围区域Ktrans、Kep、Ve值均无相关性。结论女性脑胶质瘤中Syntenin可通过与FAK相互作用经相应的信号通路提升肿瘤细胞的侵袭和转移能力；动态增强MRI可准确反映脑胶质瘤和脑转移瘤实性部分和瘤周区域的血脑屏障损坏程度，在两者鉴别诊断中具有重要价值。

脑胶质瘤；多配体蛋白聚糖结合蛋白；黏着斑激酶；脑转移瘤

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，具有恶性生长、侵袭性强、预后不佳等特点，其中胶质瘤高度侵袭性和转移性是复发和病死的主要原因。多配体蛋白聚糖结合蛋白(Syntenin)是从人黑色素瘤细胞中克隆出来的一种支架蛋白，可通过上调自身PDZ结构域上黏着斑激酶(FAK)活性来介导多种肿瘤侵袭和转移〔1〕。而Syntenin能否通过与FAK相互作用来影响脑胶质瘤的侵袭、迁移仍未明确〔2〕。本研究探讨Syntenin促进脑胶质瘤侵袭、转移的分子机制，并分析其中脑胶质瘤和转移瘤的动态增强MRI参数特点。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2015年3月至2016年3月在本院进行 MRI 检查，并经手术证实的脑肿瘤患者45例，均为女性。其中胶质瘤26例，年龄56～72〔平均(63.40±8.95)〕岁；胶质瘤Ⅰ级4例、Ⅱ级9例、Ⅲ级7例、Ⅳ级6例。脑转移瘤19例(原发部位为卵巢、乳腺、肺)，年龄58～79〔平均(65.11±9.27)〕岁。入选患者均为首次手术治疗，无化疗史，术前均行常规MRI和DCE-MRI扫描，自愿参与本次研究。脑胶质瘤组织由胶质瘤患者手术切除获得，经生理盐水洗净后，液氮速冻15 s，-80℃保存备用。

1.2主要试剂兔抗人Syntenin、FAK Tyr397多克隆抗体(上海丰寿生物科技有限公司)，小鼠抗人β-actin单克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司)，RIPA裂解液(西安晶彩生物科技有限公司)，Trizol、PCR试剂盒(上海浩然生物技术有限公司)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3胶质瘤组织中Syntenin mRNA、FAK mRNA检测采用RT-PCR技术检测，取100 mg脑胶质瘤组织标本，Trizol一步法提取总RNA，紫紫外分光光度法测定其纯度和含量，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。-20℃保存备用。反应体系30 μl，包括：蒸馏水16 μl，缓冲液5 μl，dNTPs(2 mmol/L)3 μl，MgSO4(30 mmol/L)3 μl，引物(10 mmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，PCR酶1 μl；采用常规两步法，共完成30个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。取3 μl PCR扩增产行琼脂糖凝胶电泳，紫外分光成像，读取积分光密度值，以 β-actin 为内参进行校正。

1.4胶质瘤组织中Syntenin、磷酸化FAK Tyr397蛋白检测采用Western印迹法检测，取脑转移瘤组织标本0.05 g，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后剪碎，加入蛋白裂解液，研磨。取组织悬液置于EP管中，4℃ 10 000 r/min离心15 min，取上清，测定蛋白浓度。取蛋白样品于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离后，转至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封闭后分别于兔抗人Syntenin、磷酸化FAK Tyr397抗体结合，4℃放于摇床孵育4 h；Tris盐酸缓冲液(TBST)漂洗后与二抗结合，4℃放于摇床孵育2 h；TBST洗涤后化学增强发光法(ECL)避光孵育，发光显示。

1.5MRI检查35例患者均使用美国GE3.0T MRI扫描仪和八通道相控阵线圈进行扫描。数据导入GE ADW3.1影像工作站，使用Image Tool进行图像处理，利用血流动力学双室模型，建立动脉输入函数(AIF)选取侧脑室体层面的上矢状窦为参照血管，标记ROI面积约为50 mm2，得到时间-对比剂浓度曲线。取肿瘤实性最大截面部分测量3个ROI，参考常规MRI扫描，避开出血、坏死、钙化、囊性病变区域，计算得到肿瘤的容积转运常数(Ktrans)、回流速率常数(Kep)、血管外细胞容积分数(Ve)，记录3个ROI中的上述变量值，计算平均值。

1.6统计学方法应用SPSS11.0软件行t检验和Pearson等级相关性分析。

2　结　果

2.1胶质瘤组织中Syntenin mRNA、FAK mRNA的表达情况不同病理分级脑的脑胶质瘤中，Syntenin mRNA/β-actin mRNA的光密度比值分别为：Ⅰ级0.00±0.00、Ⅱ级0.40±0.02、Ⅲ级0.71±0.02、Ⅳ级0.94±0.01；FAK mRNA /β-actin mRNA的光密度比值分别为：Ⅰ级0.90±0.01、Ⅱ级1.16±0.09、Ⅲ级1.42±0.04、Ⅳ级1.89±0.04。Syntenin mRNA、FAK mRNA表达水平在不同病理分级的脑胶质瘤中差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson分析显示，Syntenin mRNA、FAK mRNA表达水平与脑胶质瘤病理等级呈正相关(r=0.891、0.963，P<0.05)。见图1。

2.2胶质瘤组织中Syntenin 与磷酸化FAK Tyr397蛋白表达情况不同病理分级脑的脑胶质瘤中Syntenin条带与β-actin条带的灰度值比值分别为：Ⅰ级0.00±0.00、Ⅱ级0.20±0.05、Ⅲ级0.39±0.03、Ⅳ级0.90±0.03；磷酸化FAK Tyr397比值分别为：Ⅰ级0.19±0.02、Ⅱ级0.30±0.02、Ⅲ级0.50±0.01、Ⅳ级0.76±0.05。Syntenin 与磷酸化FAK Tyr397蛋白表达水平在不同病理分级的脑胶质瘤中均有统计学差异(P<0.05)。Pearson分析显示，Syntenin 与磷酸化FAK Tyr397蛋白表达水平与脑胶质瘤病理等级呈正相关(r=0.962、0.947，P<0.05)。Syntenin 蛋白表达水平与FAK Tyr397呈正相关(r=0.935，P<0.05)。见图2。

2.3胶质瘤与转移瘤影像学测量参数比较胶质瘤与转移瘤的瘤实质Ktrans、Kep、Ve值之间均无统计学差异(P>0.05)。胶角质母细胞瘤周围区域Ktrans、Kep、Ve值均明显高于转移瘤周围区域(P<0.05)。见表1。

图1　不同病理分级脑胶质瘤中Syntenin mRNA、FAK mRNA表达变化

图2　不同病理分级脑胶质瘤中Syntenin 与磷酸化FAK Tyr397蛋白表达变化

类型n Ktrans 瘤实质瘤周围 Kep 瘤实质瘤周围 Ve 瘤实质瘤周围胶质瘤260.26±0.070.09±0.041)0.40±0.090.42±0.091)0.64±0.100.11±0.031)转移瘤190.24±0.060.04±0.020.36±0.050.21±0.050.68±0.120.07±0.02

与转移瘤相比：1)P<0.05

2.4瘤实质Ktrans值与其周围区域Ktrans、Kep、Ve值相关性分析胶质瘤Ktrans值与周围区域Ktrans、Kep、Ve值均呈正相关(r=0.762、0.475、0.662，P<0.05)。脑转移瘤Ktrans值与周围区域Ktrans、Kep、Ve值均无相关性(r=0.251、0.030、0.105，P>0.05)。

3　讨　论

Syntenin是包含2个PDZ结构域的支架蛋白，在多种恶性肿瘤细胞系中均呈过度表达，并且与肿瘤恶性程度及病情进展紧密相连。研究发现，脑胶质瘤组织中Syntenin表达水平随组织恶性程度的增加而上升〔3〕。分子机制研究显示，Syntenin通过上调FAK活性来介导黑色素瘤转移〔4〕，而Syntenin能否通过与FAK相互作用来影响脑胶质瘤的侵袭、迁移，目前仍未明确。

本研究提示脑胶质瘤细胞中Syntenin可通过与FAK相互作用，通过对应的信号通路来调控细胞结构重组、黏着斑形成、降解等过程，促进脑胶质瘤细胞的转移和侵袭〔5〕。相关研究显示，FAK的C末端仍未发现和PDZ结构域相结合的基因序列〔6〕，说明黏着斑中Syntenin和FAK的相互作用还需要其他分子介导。本次研究说明在脑胶质瘤中，Syntenin能够通过提升整合素介导的FAK信号通路来促进脑胶质瘤细胞的转移和侵袭。

动态增强MRI可通过追踪对比剂来评估血脑屏障结构完整性和脑中血流动力学，分为定量和半定量参数分析，半定量参数主要反映肿瘤组织中的灌注情况，定量参数可分析肿瘤的血管通透性，包括Ktrans、Kep、Ve值，其关系可用Ve=Ktrans/Kep表示，数值越高说明血管通透性越强〔7〕。本次研究提示脑胶质瘤和脑转移瘤破坏血脑屏障方面无明显差异，说明上述肿瘤具有类似的恶性肿瘤特性。

瘤周区域包括肿瘤浸润区、肿瘤组织周围水肿区。本次研究说明脑胶质瘤周区域的血管通透性增加，血脑屏障损坏程度明显高于脑转移瘤。脑胶质瘤中有明显的血管增生，对周围组织有较强浸润性，瘤周微循环出现异常，主要与其内生皮细胞间距增宽，由血管通透性增加引发。脑转移瘤周区域无肿瘤细胞，Ktrans、Kep、Ve值相对较低。本次研究结果和肿瘤自身特征相吻合，脑胶质瘤和转移瘤的瘤周区域的微血管通透性存在明显差异，对这其鉴别诊断具有重要价值。

1Kegelman TP,Das SK，Emdad L,etal.Targeting tumor invasion:the roles of MDA-9/Syntenin〔J〕.Expert Opin Ther Target，2015；19(1):97-112.

2晋晖.氢质子磁共振波谱在脑胶质瘤临床应用中的价值〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(7):1815-6.

3Hwangbo C，Park J，Lee JH，etal.mda-9/Syntenin protein positively regulates the activation of Akt protein by facilitating integrin-linked kinase adaptor function during adhesion to type I collagen〔J〕.J Biol Chem，2011；286(38):33601-12.

4Sala-Valdés M，Gordón-Alonso M，Tejera E，etal.Association of syntenin-1 with M-RIP polarizes Rac-1 activation during chemotaxis and immune interactions〔J〕.J Cell Sci，2012；125(5):1235-46.

5Das SK，Bhutia SK，Kegelman TP，etal.MDA-9/syntenin:a positive gatekeeper of melanoma metastasis〔J〕.Front Biosci，2012；17(1):1-15.

6Kegelman TP，Das SK，Hu B,etal.MDA-9/syntenin is a key regulator of glioma pathogenesis〔J〕.Neurol Oncol，2014；16(1):50-61.

7李永丽，连建敏，窦社伟，等.脑胶质瘤术后放疗后复发和放射性脑坏死磁共振弥散张量成像鉴别〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2013；48(3):362-5.

〔2015-12-11修回〕

(编辑袁左鸣)

北京市自然科学基金重大项目(20147110001)；北京市海淀区科技发展计划项目(K20110069)

周秀云(1964-)，女，副主任医师，主要从事超声影像学诊断研究。

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A

1005-9202(2016)18-4496-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.045