王爱梅　耿若君　李　弋　陈亚奇　未小明　张　珊　张　廷

(南阳医学高等专科学校，河南　南阳　473061)



旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响及机制

王爱梅耿若君李弋陈亚奇未小明张珊张廷

(南阳医学高等专科学校，河南南阳473061)

目的研究旱莲草对老年痴呆模型大鼠的抗痴呆作用机制。方法选用健康成年SD大鼠，随机分为对照组、模型组、旱莲草低、高剂量组，每组10只。采用皮下注射D-半乳糖联合双侧海马注射Aβ25～35构建痴呆模型大鼠，同时每天给予生理盐水或不同剂量的旱莲草水提物灌胃治疗8 w。用药结束后，分别观察各组大鼠的学习记忆能力、海马神经元形态学变化及海马组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)的酶学活性。结果与对照组相比，模型组的反应时间延长，潜伏期缩短，错误次数增加(P<0.01)；与模型组相比，旱莲草高剂量组反应时间明显缩短，潜伏期明显延长，错误次数显著降低(P<0.01)；光镜下，与对照组相比，模型组锥体细胞明显减少，细胞排列稀疏，结构不清楚；与模型组相比，旱莲草高剂量组锥体细胞形态结构基本正常，细胞脱失现象较少；与对照组相比，模型组大鼠海马中SOD的活性明显降低，MDA的含量明显增多，ChAT活性明显下降，AChE活性明显增加(P<0.01)；与模型组相比，旱莲草高剂量组大鼠海马中SOD的活性明显增加，MDA的含量明显减少，ChAT活性明显升高，AChE活性明显降低(P<0.01)。结论旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆功能具有改善作用，其机制可能与改善大鼠海马神经元形态结构，减少神经细胞的丢失，增加SOD的活性，减少MDA的含量，增加ChAT的活性，降低AChE的活性有关。

旱莲草；痴呆；超氧化物歧化酶；丙二醛；胆碱乙酰转移酶；乙酰胆碱酯酶

旱莲草为菊科一年生草本植物鳢肠的全草，为中医常用的养肝益肾、凉血止血药物。近年研究显示，旱莲草具有免疫调节〔1〕，抗炎、镇痛〔2,3〕，抗衰老、清除自由基〔4〕的作用。有研究报道，临床服用含有旱莲草的复方抗衰老胶囊，可以有效改善老年痴呆的临床症状〔5〕。但旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆的作用及机制则少有报道。本实验观察旱莲草对痴呆模型大鼠学习记忆能力影响及机制。

1　材料与方法

1.1实验动物健康成年SD大鼠40只，SPF级，体重(220±20)g，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供〔许可证号：SCXK(豫)2010-0002〕。

1.2实验药物及试剂D-半乳糖，上海国药集团化学试剂有限公司，批号20130812；Aβ25～35，美国Sigma试剂公司，批号：A4559；旱莲草，河南省南阳市医药公司；20%乌拉坦，上海国药集团化学试剂有限公司，批号T20130810；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20130916。

1.3实验仪器立体定位仪，成都仪器厂；大鼠跳台仪，中国医学科学院药物研究所；V-1200型可见分光光度计，上海棱谱仪器仪表有限公司；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆机，江苏金运市环宇科学仪器厂；SSW型微电脑电热恒温槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AE-100型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.4旱莲草提取物的制备取旱莲草500 g 加自来水2 500 ml煎煮30 min，四层纱布过滤，药渣用2 000 ml自来水煎煮30 min过滤，合并滤液，浓缩至1 g/ml，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.5方法

1.5.1动物分组及给药实验动物在标准环境适应性饲养1 w后，随机分为对照组、模型组、旱莲草低、高剂量组，每组10只。模型组：皮下注射D-半乳糖 150 mg·kg-1·d-1，连续6 w，第7周双侧海马注射4 nmol/L的 Aβ25～35(用0.9%的生理盐水溶解)；对照组：皮下注射等量生理盐水，连续6 w，第7周双侧海马注射等量生理盐水；旱莲草低、高剂量组：皮下及双侧海马注射与模型组相同，旱莲草组第1天即开始分别给予8、24 g/kg旱莲草水提物灌胃，均为1次/d，连续8 w，对照组和模型组每天给予等剂量的生理盐水灌胃，连续8 w。各组动物每周记录1次体重，调整注射剂量。

实验全程双侧海马注射1次：将进入实验第7周的SD大鼠称重后腹腔注射10% 水合氯醛 (0.3 ml/100 g) 麻醉，然后将其固定于脑立体定位仪上，头顶皮肤剪毛，碘伏消毒，范围直径 3～4 cm。手术刀正中矢状划开头皮，剥离骨膜，暴露前囱点(Bergam点)，以 Bergam 点为坐标原点，参照 Paxinos 大鼠脑立体定位图谱〔6〕，由Bergam点向后3.2 mm，中线旁2.2 mm，用骨钻钻透双侧颅骨，在脑立体定位仪引导下，通过微量注射器将总量为4 μl的Aβ25～35溶液或生理盐水缓慢注入双侧海马组织内 (每侧2 μl)，深度为4 mm，速度为0.2 μl/min，注射完留针5 min。注射药物或生理盐水后，颅骨上的注射孔用骨蜡封口、皮肤缝合并给予抗生素处理。

1.5.2大鼠学习记忆能力测定(跳台实验) 将大鼠放入装置中适应3 min后通以36 V交流电，大鼠受到电击后将跳到平台上躲避电击。记录反应期(通电后大鼠跳上平台的时间)和错误次数(5 min 内受到电击的次数)作为学习成绩。24 h后重复试验，将大鼠放在平台上即刻通电，记录潜伏期(5 min 内大鼠从台上跳到铜栅上的时间)和错误次数(受到电击的次数)作为记忆成绩。

1.5.3SOD、MDA、ChAT和AChE检测最后一次跳台实验结束之后，将大鼠断头处死，在冰冻手术台上迅速取脑，分离两侧大脑半球，取出海马组织，按照试剂盒要求进行SOD、MDA、ChAT和AChE的检测。

1.6统计学方法采用SPSS18.0统计软件包进行方差分析，组间比较用LSD-t检验。

2　结　果

2.1各组大鼠学习记忆能力比较(跳台实验法)与对照组相比，模型组反应时间延长，潜伏期缩短，错误次数增加(P<0.01)；与模型组相比，旱莲草高剂量组反应时间明显缩短，潜伏期明显延长，错误次数显著降低(P<0.01)，表明大鼠的学习记忆能力较模型组有所改善。见表1。

2.2旱莲草对老年痴呆模型大鼠海马神经元形态结构的影响光镜下，与对照组相比，模型组海马CA1区锥体细胞明显减少，细胞排列紊乱，细胞脱失明显，结构不清楚；与模型组相比，旱莲草低剂量组海马CA1区锥体细胞排列不整齐，细胞有脱失，旱莲草高剂量组海马CA1区锥体细胞形态结构基本正常，细胞脱失现象较少，见图1，说明旱莲草对老年痴呆模型大鼠海马神经元起到一定的保护作用。

表1　旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响

与对照组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.01,3)P<0.05

图1　大鼠海马CA1区神经元形态结构改变(HE，×400)

2.3旱莲草对老年痴呆模型大鼠海马SOD、MDA、ChAT和AChE的影响与对照组相比，模型组大鼠海马中SOD的活性明显降低，MDA的含量明显增多，ChAT活性明显下降，AChE活性明显增加(P<0.01)；与模型组相比，旱莲草高剂量组大鼠海马中SOD的活性明显增加，MDA的含量明显减少，ChAT活性明显升高，AChE活性明显降低(P<0.01)。旱莲草低剂量组和模型组之间上述指标无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2　大鼠海马SOD、MDA、ChAT和AChE检测结果

与对照组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01;与旱莲草高剂量组比较：3)P<0.01

3　讨　论

中医药在老年痴呆的预防、治疗、保健康复等方面有显著的优势。中药有效成分治疗老年痴呆的机制主要包括清除自由基及抗氧化、改善中枢胆碱能神经系统功能、抑制神经元凋亡，促进神经元新生、脑缺血再灌注损伤的保护作用、钙拮抗作用等〔7〕。现代药理学研究表明，旱莲草作为传统中药，具有止血、保肝、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种药理作用〔1～4,8〕。Kim等〔7〕的研究表明旱莲草的丁醇馏分可以增加剖宫产大鼠脑内神经递质乙酰胆碱的含量，降低脑内和血清中的氧化应激物。国内亦有研究表明含有旱莲草成分的复方中药制剂可以通过清除自由基、抗氧化作用达到改善老年痴呆患者临床症状〔5〕。但是旱莲草对空间学习记忆能力的影响及作用机制的研究则少有报道，说明旱莲草对治疗AD 模型大鼠的学习记忆能力均有改善，而且采用高剂量治疗疗效更好。

近年研究显示〔9,10〕，学习记忆功能减退与海马组织的重量减轻，脑内神经元数目减少及神经元突触的可塑性变化有关且AD 患者海马的病变往往早于大脑皮质的改变。在AD 早期大脑皮质还未出现病变以前，海马就可出现大量的神经纤维缠结及明显的神经元缺失，且随着病程的延长，病变有加重的趋势。本实验中模型组大鼠海马结构研究显示，海马轮廓模糊，神经元细胞数目减少，细胞间界限不清；旱莲草高剂量组可以使上述指标明显改善，海马锥体细胞形态结构基本恢复正常，细胞脱失减少，说明旱莲草对受到伤害的海马神经元细胞具有保护作用。

近期研究〔11～13〕结果提示，早期抗氧化措施对延缓老年痴呆症发生可能会有一定帮助。本实验结果表明旱莲草能提高老年痴呆模型大鼠海马中SOD，降低MDA含量，从而起到拮抗自由基损伤防治AD的作用。

脑内胆碱能神经元的丢失，是AD最重要的病理学特征之一。胆碱能神经元缺失导致脑内与学习记忆密切相关的神经递质乙酰胆碱的减少，是AD学习记忆障碍的重要机制〔14〕。ChAT是合成乙酰胆碱的关键酶，AChE是降解乙酰胆碱的关键酶。ChAT和AChE的活性与脑内乙酰胆碱的含量密切相关，两者共同维持了乙酰胆碱含量的动态平衡。本实验结果说明旱莲草可以提高老年痴呆模型大鼠海马中ChAT活性，抑制AChE活性，从而增加海马中乙酰胆碱的含量，在改善学习记忆功能方面发挥一定的作用。

综上所述，旱莲草对老年痴呆模型大鼠学习记忆功能具有改善作用，其机制可能与改善AD模型大鼠海马神经元形态结构，减少神经细胞的丢失，增加SOD的活性，减少MDA的含量，升高ChAT的活性，降低AChE的活性有关。

1Liu QM,Zhao HY,Zhong XK,etal.Eclipta prostrata L.phytochemicals:isolation,structure elucidation and their antitumor activity〔J〕.Food Chem Toxicol,2012;50(11):4016-22.

2Ryu S,Shin JS,Jung JY,etal.Echinocystic acid isolated from eclipta prostrata suppresses lipopolysaccharide-induced iNOS,TNF-alpha and IL-6 expressions via NF-kappaB inactivation in RAW 264.7 macrophages〔J〕.Planta Med,2013;79(12):1031-7.

3Tewtrakul S,Subhadhirasakul S,Tansakul P,etal.Antiinflammatory constituents from Eclipta prostrata using RAW264.7 macrophage cells〔J〕.Phytother Res,2011;25(9):1013-6.

4Chan CF,Huang WY,Guo HY,etal.Potent antioxidative and UVB protective effect of water extract of Eclipta prostrata L〔J〕.Sci World J,2014;2014:759039.

5张大宁，张宗礼，车树强，等.补活抗衰老胶囊对30例老年痴呆氧自由基代谢的影响〔J〕.陕西中医,2003;24(2):120-2.

6Watson C,Paxinos G.The rat brain in stereotaxic coordinates〔M〕.6th ed.Amsterdam:Academic Press/Elsevier,2007:1.

7Kim DI,Lee SH,Hong JH,etal.The butanol fraction of Eclipta prostrata (Linn) increases the formation of brain acetylcholine and decreases oxidative stress in the brain and serum of cesarean-derived rats〔J〕.Nutr Res,2010;30(8):579-84.

8Xia Y,Chen J,Cao Y,etal.Wedelolactone exhibits anti-fibrotic effects on human hepatic stellate cell line LX-2〔J〕.Eur J Pharmacol,2013;714(1-3):105-11.

9Takata K.Molecular targeting and translational research for new therapeutic strategies on Alzheimer′s disease〔J〕.Yakugaku Zasshi,2013;133(12):1389-99.

10Cooke SF,Bliss TV.Plasticity in the human central nervous system〔J〕.Brain,2006;129(Pt 7):1659-73.

11陈地灵，张鹏，林励，等.巴戟天低聚糖对Aβ_(25-35)致拟痴呆模型大鼠的保护作用〔J〕.中国中药杂志,2013;30(9):1306-9.

12Zara S,Di Stefano A,Nasuti C,etal.NOS-mediated morphological and molecular modifications in rats infused with Abeta (1-40),as a model of Alzheimer′s disease,in response to a new lipophilic molecular combination codrug-1〔J〕.Exp Gerontol,2011;46(4):273-81.

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14Grothe M,Zaborszky L,Atienza M,etal.Reduction of basal forebrain cholinergic system parallels cognitive impairment in patients at high risk of developing Alzheimer′s disease〔J〕.Cereb Cortex,2010;20(7):1685-95.

〔2014-12-05修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

河南省重点科技攻关项目(No.132102310263)

王爱梅(1973-)，女，硕士，副教授，主要从事神经生理学研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)18-4413-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.004