张　洁, 林文武, 宛柏杰, 余小芳, 吴祖建

(1.福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室，福建 福州 350002；2.拜耳作物科学(中国)有限公司，浙江 杭州 310018)



福州番茄黄化曲叶病毒的全基因组结构特征

张洁1, 林文武1, 宛柏杰1, 余小芳2, 吴祖建1

(1.福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室，福建 福州 350002；2.拜耳作物科学(中国)有限公司，浙江 杭州 310018)

为明确引起福建省福州市长乐地区番茄上曲叶症状的病原，提取样品总DNA，利用简并引物PA/PB进行PCR扩增，从10个样品中均可扩增到500 bp左右的特异条带.NCBI BLAST序列比对表明，该序列与番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)核苷酸序列相似性最高，达99.0%.再根据已知500 bp序列设计1对反向引物，扩增TYLCV分离物Fz01全基因组近全长，克隆并测序.经序列拼接发现，TYLCV分离物Fz01基因组全长2781 nts(KP685598)，与已报道的TYLCV其他各分离物相似性均在89.3%以上，而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的相似性均在98.7%以上.因此，Fz01属于TYLCV的一个分离物.

福州; 番茄黄化曲叶病毒; 全基因组; 序列分析

番茄黄化曲叶病毒病主要由番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)侵染所致.2006年首次报道TYLCV入侵我国[1]，目前该病毒已经在我国20多个省(市)发生，并造成严重损失.番茄感病后植株矮化，顶部叶片发黄、变小，叶片边缘上卷、皱缩等，果实的产量和商品价值降低[2-3].

TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus).根据基因组结构的不同，TYLCV可以分为双组份(DNA-A和DNA-B)和单组份(DNA-A)2种类型，大多数单组份双生病毒还伴随有卫星DNA(satellite DNA)，称为DNA β[4].目前，国内外发现的TYLCV大部分为DNA-A单组份病毒，基因组大小为2.7～2.8 kb[1-3].

福建省位于中国东南沿海，属于高温多雨的季风亚热带气候，植物种类丰富，植物病毒也多样化，仅福建省植物病毒学重点实验室检测并鉴定的双生病毒就达14种之多.2014年秋季，福州市长乐地区的番茄植株表现严重的曲叶症状，疑似感染了TYLCV.因此，本文对此番茄病样的病原进行分子鉴定，并测定病毒分离物Fz01全长序列，分析其序列同源性及结构特征，以期为该病毒的防治提供依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病样来源2014年11月采集福建省福州市长乐地区的番茄样本，病株均表现为曲叶、叶缘黄化的症状.

1.1.2菌株和载体大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存，克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司.

1.1.3试剂DNA凝胶纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯.

1.2试验方法

1.2.1植物总DNA的提取利用CTAB法[5]提取各样本番茄叶片总DNA.

1.2.2PCR扩增、克隆和测序(1)DNA-A的扩增.利用菜豆金色花叶病毒属病毒DNA-A保守序列设计的简并引物PA/PB[6]对样品DNA进行PCR扩增，扩增产物经DNA凝胶纯化试剂盒纯化，与载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，送交上海博尚生物技术有限公司测序.再根据测得的序列设计1对反向引物TY-Full-F(5′-GACACTTATCTAACGTTTGAGGATG-3′)/TY-Full-R(5′-CACAAACAAGCGACGATCATG-3′)，扩增病毒DNA-A的近全长序列，克隆并测序.

(2)DNA-B和DNA β的扩增.利用DNA-B和DNA β的通用引物[7-9]对样品DNA进行PCR扩增.

1.2.3序列分析利用DNAStar分析软件(DNAStar Inc., Madison, WI, USA)中的MegAlign程序及Clustal W方法比较序列相似性.通过NCBI BLAST查找序列相似性.系统关系树的构建采用Mrbaye软件的贝叶斯法.

2　结果与分析

2.1样品的PCR检测及TYLCV Fz01 DNA-A基因组结构特征

利用简并引物PA和PB，对10个表现曲叶症状的番茄样品进行PCR扩增，均得到约500 bp的特异性条带(图1A).测序结果表明，10个病样的序列相似性均在98.2%以上；NCBI BLAST显示，与TYLCV很多分离物的相应序列高度同源，达99.0%.PCR扩增样品Fz01近全长序列，可以得到1条约2.4 kb的特异性条带(图1B).克隆、测序并拼接全长序列，命名为TYLCV Fz01.序列分析发现，TYLCV Fz01 DNA-A全长2781 nts(GenBank登录号为KP685598)，其DNA-A基因组结构具有典型的双生病毒特性，共编码6个开放阅读框(open frame reading, ORFs)：病毒链编码2个ORFs，分别为AV1(308～1084 nt)和AV2(148～498 nt)，互补链编码4个ORFs，分别为AC1(1542～2615 nt)、AC2(1226～1633 nt)、AC3(1081～1485 nt)和AC4(2171～2464 nt).AC4与AV2之间的基因间隔区(intergenic region,IR)内含有病毒复制和转录必需的各种元件，包括一条含有9个核苷酸TAATATT/AC(2～2775 nt)的茎环结构.利用通用引物对样品进行DNA-B和DNA β的PCR扩增，但均未检测到任何特异性条带.

A.10个番茄样本中TYLCV DNA-A 500 bp部分片段的PCR检测;B.TYLCV Fz01近全长序列的PCR扩增.M.分子质量标准；CK.阴性对照.

2.2TYLCV Fz01 DNA-A与其他双生病毒的同源性比较

选取全国不同地区具有代表性的分离物以及国外相似性较近的一些TYLCV分离物构建系统关系树，以TYLCV伊朗(Iran)和苏丹(Sudan)分离物为外群.结果表明，TYLCV Fz01与我国新疆、上海、北京、广东、河北等地区的TYLCV聚类为一个大分支(图2)，连同澳大利亚(Australia)、墨西哥(Mexico)、美国(USA)、哥斯达黎加(Costa Rica)等国家的一些分离物属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系(TYLCV-IL).序列相似性比对发现，TYLCV Fz01与以上TYLCV分离物的相似性都在89.3%以上(表1).IR是基因组中变异最大的区域，TYLCV Fz01的IR序列长度为313 nts，与伊朗和苏丹分离物IR序列相似性仅为84.5%和70.6%，而与其他以色列株系的分离物相似性都在94.9%以上(表1).氨基酸相似性比对发现，TYLCV Fz01的AV1、AV2和AC4序列高度保守，与TYLCV其他分离物的氨基酸序列相似性均高达100.0%(表1).以上结果充分说明TYLCV保守性极高，并未因地理来源的不同产生较大变异.

图2　基于TYLCV Fz01 DNA-A与18个TYLCV其他分离物DNA-A全长基因组核苷酸序列构建的系统关系树

3　讨论

本研究对福建省福州市长乐地区的番茄病样进行了分子生物学检测，并进一步获得TYLCV Fz01的全基因组序列，该序列与国内外已报道的TYLCV各分离物相似性均在89.0%以上，而与我国其他地区及美国等国家的TYLCV-IL株系分离物的相似性均在98.0%以上.根据国际上双生病毒分类原则[10]，确定侵染福州长乐地区番茄植株的病原为TYLCV的一个分离物.

本试验利用DNA-B和betasatellite的通用引物对样品DNA进行PCR扩增，未检测到任何特异性条带，说明福州地区的TYLCV是单组份病毒，这与国内外的报道相一致.Zhang et al[11]研究发现，中国番茄黄化曲叶病毒伴随的卫星分子(DNA β)可促进TYLCV在番茄及烟草中复制，产生更加严重的症状.关于TYLCV是否会与其他双生病毒/卫星分子复合侵染产生更严重的危害，还需要进一步检测.

表1　TYLCV Fz01与18个TYLCV其他分离物DNA-A、IR及其各ORFs的序列相似性比较Table 1　Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of complete DNA-A, IR and ORF between Fz01 DNA-A and other 18 TYLCV isolates　%

致谢：特别感谢福建农林大学植物病毒研究所的高芳銮博士给予序列分析方面的指导.

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(责任编辑:杨郁霞)

Molecular characterization ofTomatoyellowleafcurlvirusin Fuzhou

ZHANG Jie1, LIN Wenwu1, WAN Baijie1, YU Xiaofang2, WU Zujian1

(1.Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province/Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Bayer CropScience (China) Co., Ltd., Hangzhou, Zhejiang 310018, China)

To identify pathogens that caused tomato leaf curl symptoms in Changle area of Fuzhou, Fujian Province, total DNA was extracted from 10 infected samples. By using degenerate primers PA/PB, 500 bp fragments were obtained from all samples. Sequence analysis showed nucleotide sequences of all fragments showed the highest identity (99.0%) with that ofTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV). To get the complete nucleotide sequence of virus isolate Fz01, a pair of reverse primers was designed according to known genome sequence. Results showed that isolate Fz01 comprised of 2781 nucleotides, reaching 89.3% identity with other isolates of TYLCV from GenBank, and more than 98.7% identity with other isolates of TYLCV from China. Therefore， the virus that infected tomato in Fuzhou was an isolate of TYLCV.

Fuzhou;Tomatoyellowleafcurlvirus; complete genome; sequence analysis

2015-11-11

2015-12-16

国家自然科学基金青年项目(31301640、31301642)；福建省教育厅科技项目(JA13103)；福建农林大学博士后项目(132300117).

张洁(1983-)，女，讲师，博士.研究方向：植物病毒学.Email:jiezhang3553@163.com.通讯作者吴祖建(1967-)，男，研究员，博士.研究方向：植物病毒学.Email:wuzujian@126.com.

S432.1

A

1671-5470(2016)05-0501-04

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.004