卢倩文，蔡　婷，秦　佳，康　辉，赵婷婷，张楠笛，向文良*

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川 成都610039；2.小金县夹金山天然野樱桃酒业有限公司，四川 阿坝 624000）

川西藏区天然野樱桃酒中有机酸含量检测方法的构建

卢倩文1，蔡婷1，秦佳2，康辉2，赵婷婷1，张楠笛1，向文良1*

（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川 成都610039；2.小金县夹金山天然野樱桃酒业有限公司，四川 阿坝 624000）

建立高效液相色谱（HPLC）法对川西藏区天然野樱桃酒中有机酸的种类和含量的检测方法。采用Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱，以7 mmol/L H2SO4溶液（pH 2.20）为流动相，流速为0.6 mL/min，柱温60℃，紫外检测器检测波长为210 nm。经过方法学验证，该检测方法重现性好、精密度及准确度高，在0.001～2.000 g/L线性范围内线性关系良好（R2＞0.99），检出限为0.000 6 g/L，加标回收率为86%～106%，重现性试验、精密度试验和回收率试验的相对标准偏差（RSD）均＜5%，适用于天然野樱桃酒中6种重要有机酸的同时检测。结果表明，川西藏区天然野樱桃酒样品中含量最高的有机酸是草酸（1.92 g/L）和L-苹果酸（0.78 g/L），其次是乙酸（0.17 g/L）和酒石酸（0.18 g/L），乳酸（0.15 g/L）和柠檬酸（0.15 g/L）含量最少。

高效液相色谱法；天然野樱桃酒；有机酸；检测

野樱桃（Cerasus tomentosa（Thunb.）Wall.）为蔷薇科落叶灌木，其果实不仅味道鲜美而且营养成分丰富；富含维生素C、各种氨基酸、花色素、糖，矿物质锌、铁、钾、锰、铜等，其中含铁量居水果首位［1-2］。四川阿坝藏区气候冷凉干燥、日照强烈，昼夜温差大，野樱桃分布十分广泛，在海拔3 500 m左右均有自然生长，树势健壮，病虫危害极少，深受消费者的青睐。但野樱桃季节性强，收获期短，一般为10～15 d［3］，并且在室温下不耐贮藏，因此对其进行深加工以延长货架期显得十分重要。将野樱桃开发成具有高附加值的野樱桃酒，不仅可保留野樱桃的大部分营养成分，延长野樱桃的货架期，而且符合粮食酒向果酒转变的国家酒类行业政策，又符合追求天然、含糖量少、酒精度低且有益于健康的果酒世界饮酒潮流［4-5］。

以科学方法酿造而成的野樱桃果酒中，含有丰富的有机酸，其种类和含量直接影响到野樱桃酒的口感和质量，还影响到野樱桃酒的颜色和陈酿效果［6-8］。因此建立一种分析和测定野樱桃酒中有机酸的方法，对野樱桃酒的生产和研发具有重要意义。目前，果汁和果酒中有机酸的分析方法主要有滴定法、比色法、酶法、气相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱（high performance liq-uid chromatography，HPLC）法等，其中滴定法［9］、比色法［10］、酶法［9-10］影响因素较多，准确度较差；气相色谱法［11］样品前处理繁琐费时；离子色谱［12］不适合做复杂的样品分析；毛细管电泳法［13］重现性存在明显不足；HPLC法［14-15］是目前有机酸分析中最成熟、也最常用的方法。

本试验旨在以采摘于川西藏区的天然野樱桃为原料，通过发酵工艺制备天然野樱桃果酒，优化色谱条件，建立一种更加方便、快捷的针对川西藏区天然野樱桃酒中6种重要有机酸（草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸和柠檬酸）的高效液相色谱法，为野樱桃的精深加工和优化野樱桃果酒工艺奠定了一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

天然野樱桃：采摘于川西藏区（阿坝州小金县）；天然野樱桃果酒：西华大学古法发酵生物技术研究所酿造。

蔗糖：市售一级；果胶酶（酶活力10 000 U/g）：美国Sigma公司；果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；皂土、硅藻土：广州市喜亿陇贸易有限公司；过氧酸：西陇化工股份有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；草酸、酒石酸（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；L-苹果酸、柠檬酸（均为色谱纯）：成都西亚试剂有限公司；乙酸、乳酸（均为色谱纯）：成都华夏化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司。

1.2仪器与设备

LPS-5离心式破碎机：旭郎机械成都分公司；WBL25C56榨汁机：美的（Midea）集团股份有限公司；5L发酵罐、陈酿罐：镇江汇能达生物工程设备有限公司；SW-CJ-2F双人洁面净化工作台：苏州净化有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱：上海益恒实验仪器有限公司；JA2003电子天平：舜宇恒平仪器有限公司；pHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；Waters2698高效液相色谱仪（2695紫外检测器）：美国Waters公司；Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱：BIO-RAD公司；UPH-Ⅱ-5T超纯水机：四川优普超纯科技有限公司。

1.3方法

1.3.1野樱桃果酒加工工艺流程及操作要点［16-18］

操作要点：

原材料预处理：挑选新鲜、颜色鲜红、成熟度高、无腐烂的野樱桃为原料，用流速为5 m3/h的流动清水洗净后，再用0.2%～0.3%过氧酸杀菌水溶液浸泡1 min后，用流动清水清洗，沥水40～50 min。

添加SO2及果胶酶处理：为抑制杂菌的生长繁殖，野樱桃打浆后应立即添加0.10～0.15 g/L SO2（120 mg/L的偏重亚流酸钾）。添加SO2约5 h后再添加0.1～0.3 g/L果胶酶（10 000 U/g）增强澄清效果和提高出汁率，果胶酶可以软化果肉组织中的果胶物质，使之分解生成半乳糖醛酸和果胶酸，使果汁中的固形物失去依托而沉降下来。

调配：添加蔗糖调整发酵培养基中的糖含量为17%～20%，用柠檬酸将培养基的pH值调至4.0～5.0。

发酵：将成分调整好的发酵液置于发酵罐中，然后加入0.03%的酵母菌进行发酵主发酵温度为24～28℃，时间为16 d，后发酵温度为16℃，发酵时间为28 d。

澄清处理：野樱桃果酒用0.2～0.4 g/L的皂土进行下胶处理，7～8 d后进行转罐，同时采用硅藻土过滤，再将澄清处理后的果酒采用错流膜过滤系统处理，操作参数为：透膜压差0.13～0.15 MPa，错流切向速度4～6 m/s，过滤时间1～2 h，酒液温度-0.5～-0.1℃和反冲间隔2～4 min。

陈酿：将澄清处理后的酒液在12～15℃陈酿3～6个月，使成品的风味得到改善，形成典型的野樱桃果酒风味。

1.3.2高效液相法检测色谱条件

色谱柱：Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱（300 mm× 7.8 mm，9 μm），流动相：7 mmol/L的H2SO4溶液（pH值为2.20），流速：0.6 mL/min，紫外检测波长：210 nm，柱温：60℃，进样量：20 μL。

1.3.3样品预处理及标准溶液的配制

样品预处理：取一定量的成品野樱桃酒经0.45 μm微孔滤膜过滤，收集滤液待测。

有机酸标准品溶液：分别称取草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸和柠檬酸各0.5 g，加超纯水溶解并分别定容到50 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1 g/L的6种有机酸的标准储备液，经0.45 μm滤膜过滤，作为定性工作液使用。

有机酸混合标准品溶液：分别精密称取草酸0.201 0 g、酒石酸0.100 2 g、L-苹果酸0.101 2 g、乙酸0.100 3 g、乳酸0.101 1 g、柠檬酸0.101 4 g用超纯水溶解于同一烧杯中，定容到100 mL容量瓶中，经0.45 μm滤膜过滤，作为定量工作液使用。

1.3.4定性定量方法

定性方法：分别将6种有机酸标准品按照1.3.2的色谱条件进行分析，以出峰时间定性确定不同的有机酸。

定量方法：将处理好的样品按照1.3.2的色谱条件进行分析，以出峰面积定量确定不同有机酸的含量。

2　结果与分析

2.1色谱条件的确定

2.1.1检测波长的确定

取有机酸混合标准溶液进行光谱扫描，扫描结果见图1，结果表明，6种有机酸在210 nm附近有较大的吸收，重复性好，且硫酸溶液在波长210 nm处几乎没有紫外吸收，故采用210 nm的紫外波长进行检测。

图1　有机酸标准品的紫外吸收光谱扫描图Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum scannogram of organic acids standard substance

2.1.2色谱柱的选择

在果酒中有机酸的检测中，色谱柱的选择尤为关键，相关文献中使用C18较多，为了使有机酸的分离效果较好，常常在流动相中要加入一定比例的有机溶剂，如甲醇和乙腈，这使色谱条件变得比较繁琐［19-20］。本研究采用Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱，该色谱柱是检测有机酸的专用柱，相比于C18柱而言，不仅可以在短时间内有效地分离多种有机酸，而且所需的流动相种类单一，大大简化了色谱条件的选择工作，提高了检测效率［21-22］。

2.1.3柱温及流动相中H2SO4浓度的确定

图2　有机酸混合标准品（A）及野樱桃果酒样品（B）的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids mixed standards（A）and the wild cherry wine sample（B）

柱温和流动相的离子强度对于有机酸的分离效果有着明显的影响［23-24］。研究了柱温和H2SO4浓度对于草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸和柠檬酸的分离效果的影响。其中分别选择45℃、50℃、55℃、60℃、65℃柱温条件，结果表明，随着温度的升高，6种有机酸的分离度增加，但当温度超过60℃时，基线漂移严重，因此选择60℃作为测试柱温，可以有效实现6种有机酸的分离。其他条件不变，考察了不同H2SO4浓度（3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L、9 mmol/L）对6种有机酸分离效果的影响，结果表明，当H2SO4的浓度为7 mmol/L时，对6种有机酸的分离达到定量要求，有机酸混合标品及野樱桃果酒样品的高效液相色谱图见图2。

2.2标准曲线和线性范围

根据1.3.3方法配制不同浓度有机酸混合对照溶液在优化色谱条件下，分别以5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL体积进样，记录峰面积。以有机酸质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制各有机酸标准曲线，对标准曲线进行线性回归，结果见表1。

表1　标准曲线回归方程及线性范围Table 1 Regression equation and linear range of standard curves

由表1可知，6种有机酸的相关系数R2均＞0.99，表明峰面积和有机酸组分质量浓度的线性相关性良好。

2.3HPLC检测方法学验证

2.3.1重现性试验

取同一标准有机酸酸样品平行测定5次，测定其峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。6种有机酸保留时间的标准偏差在0.09～0.18，RSD均＜2%，表明该方法具有较好的重现性。

表2　重现性试验结果Table 2 Results of repeatability experiments

2.3.2精密度试验

取6种有机酸标品混合溶液5 mL，按照优化色谱条件，连续进样5次，记录色谱图，分别计算各有机酸峰面积的相对标准偏差，结果见表3。由表3可知，6种有机酸检测结果RSD均＜2%，表明该方法精密度较好。

表3　精密度试验结果Table 3 Results of precision experiments

2.3.3回收率试验

取成品野樱桃果酒4份，其中1份作为本底，另3份分别添加高、中、低浓度的草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸、柠檬酸标准液，进行加标回收率试验，结果见表4。由表4可知，该方法的回收率在87%～106%之间，RSD均＜3%，表明该方法准确度较好。

表4　加标回收率试验结果Table 4 Results of adding standard recovery rate experiments

2.4天然野樱桃酒中有机酸的检测

制备野樱桃果酒，按照优化色谱条件进样，设3次重复，测定野樱桃酒中有机酸的含量。结果表明，天然野樱桃酒中有机酸以草酸和L-苹果酸为主，占总酸含量的80.8%，质量浓度分别为1.920 g/L、0.778 g/L，其中柠檬酸0.145 g/L、酒石酸0.179 g/L、乳酸0.148 g/L、乙酸0.169g/L。野樱桃酒中有机酸的含量由高到低依次为：草酸＞L-苹果酸＞酒石酸＞乙酸＞乳酸＞柠檬酸。

3　结论

以采摘川西藏区生长的天然野樱桃为原料，经过酿造发酵得到天然野樱桃果酒，利用HPLC法检测到成品酒中草酸、柠檬酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸和冰乙酸的含量分别为1.920 g/L、0.145 g/L、0.179 g/L、0.778 g/L、0.148 g/L和0.169 g/L。本试验采用二极管阵列检测器，Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱，以7mmol/L的H2SO4溶液（pH值为2.20）为流动相，流速为0.6 mL/min，检测波长为210 nm，柱温60℃，6种有机酸在15 min内得到有效分离和定量。本检测方法样品前处理方法简单，建立了一种快速、便捷、高效测定野樱桃酒中有机酸的方法，在0.001～2.000 g/L线性范围内线性关系良好（R2＞0.99），检出限为0.000 6 g/L，加标回收率为86%～106%，重现性、精密度和加标回收率试验结果的相对标准偏差（RSD）均＜5%。同时，对川西藏区的天然野樱桃中的6种主要有机酸进行了定量分析，这对川西藏区天然野樱桃的后续加工中的品质控制提供了一定参考。

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Establishment of detection method of organic acids contents in natural wild cherry wine in western Sichuan Tibetan areas

LU Qianwen1，CAI Ting1，QIN Jia2，KANG Hui2，ZHAO Tingting1，ZHANG Nandi1，XIANG Wenliang1*（1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan，Institute of Ancient Brewing Technology，College of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Xiaojin Jiajin Natural Wild Cherry Wine Co.，Ltd.，Aba 624000，China）

A HPLC method for determination of different kinds and contents of organic acids in natural wild cherry wine from western Sichuan Tibetan areas was established.Using Aminex HPX-87H ion exclusion chromatography column，7 mmol/L H2SO4as mobile phase，flow rate 0.6 ml/min，column temperature 60℃and detection wavelength 210 nm，the organic acids was determined by HPLC.Through the methodology validation，the detection method had good reproducibility，high precision and accuracy.The method had a good linear relationship in the range of 0.001-2.000 g/L，the limit of determination was 0.000 6 g/L，the adding standard recovery rate was 86%-106%，the relative standard deviation of reproducibility，precision and recovery rate experiments was all less than 5%，which indicated that the method was suitable for simultaneous detection of six kinds of important organic acids in natural wild cherry wine.The results showed that the highest contents of organic acids in natural wild cherry wine from western Sichuan Tibetan areas were oxalic acid（1.92 g/L）and L-malic acid（0.78 g/L），followed by acetic acid（0.17 g/L）and tartaric acid（0.18 g/L），the contents of lactic acid（0.15 g/L）and citric acid（0.15 g/L）were the lowest.

HPLC；natural wild cherry wine；organic acids；detection

TS262.7

0254-5071（2016）09-0154-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.035

2016-04-26

教育部春晖计划项目（Z2014061）；四川省应用基础项目（2014JY0045）；四川省科技支撑计划（2016FZ0023）；四川省教育厅重点项目（14ZA0110；14Z0107）

卢倩文（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物分子生态。

向文良（1973-），男，教授，博士，研究方向为中国西南地区特色发酵食品微生物分子生态与生物过程学。