王　攀，隗程峰，蔡凤娇，汪江波*

（湖北工业大学 生物工程与食品学院 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

酵母胞外酶的产酯发酵条件优化研究

王攀，隗程峰，蔡凤娇，汪江波*

（湖北工业大学 生物工程与食品学院 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

以观音土曲中的一株酵母菌Y2为研究对象，将菌株Y2在发酵培养基培养后取其胞外酶，并将其运用于酯化反应体系中进行催化反应，以产酯能力为评价指标，先后采用单因素试验和正交试验优化菌株Y2产酯发酵条件。结果表明，当酵母菌接种量为4%、培养基初始pH值为5、发酵温度为30℃、发酵时间为4 d时，菌株Y2具有最高产酯力1.24 g/L。

酵母；胞外酶；产酯发酵条件；优化

酯化酶是脂肪酶和酯酶的统称，它与短碳链酯类的合成有关。传统白酒酿造所用曲含有大量的微生物，它们是白酒酿造的天然“发动机”及“风味调节师”。其中的产酯酵母就是非常重要的一类菌种，它们能代谢产生酯化酶。酯化酶能催化白酒发酵体系中的醇类与酸类发生酯化反应而产生酯类物质。酯类物质是白酒体系的风味调节剂，特别是乙酸乙酯，它在酯类物质中处于主导地位，其含量高低很大程度决定着清香型白酒的质量及风格，是清香型小曲白酒的特征香味成分之一［1-5］。

有研究表明，清香型小曲酒中乙酸乙酯是由生香酵母在发酵过程中利用葡萄糖后首先代谢乙醇和乙酸，而后在酵母产生的酯化酶作用下生成的。因此，筛选适合清香型白酒酿造的优质产酯酵母对清香型白酒优质高效酿造具有重要的实用价值。在清香型小曲酒的酿造过程中，小曲为白酒酿造提供各种酶类，这些酶促使原料所含的淀粉、蛋白质等高分子物质的水解，保证了黄酒发酵的正常进行；同时生长在小曲表面的产酯酵母一方面利用原料进行酒精代谢，另一方面一些产酯酵母分泌酯化酶使得酒体用有以乙酸乙酯为主的酯类物质，赋予白酒酒体独特的风格，保证了白酒的品质。相比于提高酒体的酒精度，提高酒体的香味物质浓度显得更加重要［6-9］。

产酯酵母被广泛用于传统发酵食品（如白酒、黄酒、葡萄酒、酱油、食醋等）当中。而在白酒行业，与大曲酒相比，清香型小曲原酒中的酯含量较低，具有较大的提升空间。传统工艺下生产的小曲就存在着品质不稳定及酒体酯类物质含量低等问题，而盲目的改动生产工艺会增大生产成本，为企业带来巨大的经济压力。本研究以观音土曲中的一株产酯酵母Y2为研究对象，通过对其发酵培养条件的优化提高其分泌胞外酯化酶的能力。这种方法不仅简单实用，而且对实际清香型小曲酒生产具有极强的指导意义，对小曲白酒传统技术的改造和提升都有着积极的现实意义［10-15］。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

酵母菌Y2：湖北工业大学生物工程与食品学院实验室。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，115℃灭菌20 min。

发酵培养基：酵母浸膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.1 g，KH2PO40.1 g，MgSO47H2O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，115℃灭菌20 min。

酚酞指示剂、浓硫酸、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司。

1.2仪器与设备

AR3130电子分析天平、FE20型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T500普通工业天平：常熟市双杰测试公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；ZWY-2102C双层恒温摇床、ZXFD-B5250鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；LDZX-75KB高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3方法

1.3.1胞外粗酶液制备

（1）将试管斜面保藏的酵母菌Y2用10 mL无菌水溶解后，倒入盛有100mLPDA培养基的250mL锥形瓶中，30℃、180 r/min恒温摇床振荡培养3 d，制成液态种子液，备用。

（2）按试验设计吸取一定量酵母菌Y2种子液，倒入装液量为100 mL/250 mL发酵培养基中，并按照试验设计培养一段时间，离心取上清液（10 000 r/min、5 min），微膜过滤得胞外粗酶液，4℃条件下保存待用。

1.3.2酵母产脂能力测定

（1）酯化反应

准确吸取1 mL乙酸于100 mL容量瓶中，再取20 mL无水乙醇，再加20 mL微膜过滤后的粗酶液，加蒸馏水至刻度线，同时做空白对照，于35℃条件下酯化5 d，待测备用。

（2）总酯含量测定

将酯化完成的待测液置入500 mL具支口的平底蒸馏烧瓶，添加100 mL蒸馏水，加热蒸馏提取，截取100 mL前馏出液，待测。

总酯含量测定采用皂化中和滴定法：准确吸取上述馏出液50.0 mL于300 mL回流瓶中，加酚酞指示剂2滴，以0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至粉红色，30 s不褪色，即为其终点，记录消耗体积作为总酸含量计算。再准确加入0.1 mol/L NaOH溶液25.0 mL，摇匀，装上回流冷凝管，于沸水浴中回流30 min（冷凝回流滴下第一滴开始计时），取下冷却至室温。然后，用0.1 mol/L硫酸标准溶液滴定至微红色刚好消失，30 s保持不变色，即为滴定终点，记录消耗的0.1 mol/L硫酸标准溶液体积。以总酯含量反映菌株总酯含量，总酯含量计算公式如下：

式中：X为发酵液样品中总酯含量，g/L；C为氧氧化钠标准溶液的物质的量浓度，mol/L；V为皂化时，加入0.1mol/L氧氧化钠标准溶液的体积，mL；C1为硫酸标准溶液的物质的量浓度，mol/L；V1为测定时，滴定消耗0.1 mol/L硫酸标准溶液的体积，mL；50为取样体积，mL；0.088为与1.00 mL氢氧化钠标准溶液（C=1.000 mol/L）相当的乙酸乙酯的质量，g。

1.3.3产酯发酵培养条件优化的单因素试验

设定发酵培养基初始pH值分别为3、4、5、6、7，发酵培养温度分别为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，发酵培养时间分别为1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，菌种接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，考察培养基初始pH值、发酵温度、发酵时间及菌种接种量对产酯酵母菌Y2总酯含量的影响。

1.3.4产酯发酵培养条件优化的正交试验

在单因素试验基础上，菌种接种量（A）、培养基初始pH（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为影响因素，以产酯酵母总酯含量为评价指标，进行L9（34）正交试验，正交试验因素与水平见表1。

表1　产酯发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for esterproducing fermentation conditions optimization

2　结果与分析

2.1产酯发酵培养条件单因素试验结果

2.1.1菌种接种量对产酯酵母总酯含量的影响

图1　接种量对酵母Y2产酯力的影响Fig.1 Effect of inoculum on ester-producing ability of yeast Y2

由图1可知，菌种接种量不同，酵母总酯含量也所有不同，当菌种接种量为4%左右时酵母总酯含量较高，测得总酯含量为1.02 g/L，在接种量为2%～4%时，酵母总酯含量随着接种量的增加而增大；在接种量为4%时，总酯含量最高；而当接种量＞4%时，酵母总酯含量又会缓慢降低。可能由于在一定生长环境中，菌种数量越多，所产总酯含量也越大，而当接种量增加时，菌种之间存在相互竞争，进而影响其总酯含量。因此，接种量4%为宜。

2.1.2培养基初始pH对酯化酵母总酯含量的影响

图2　初始pH对酵母Y2产酯力的影响Fig.2 Effect of initial pH on ester-producing ability of yeast Y2

由图2可知，当发酵培养基初始pH值在3～7范围内时，酵母的总酯含量呈现先上升后下降的趋势，当初始pH值为3～5时，酵母的总酯含量随着pH的升高而增加；当发酵培养基初始pH值为5左右时，该菌株总酯含量达到最高，测定得总酯含量为1.01 g/L；当发酵培养基初始pH值＞5之后，菌株总酯含量有所下降。因此，选择培养基最佳初始pH值为5。

2.1.3发酵温度对产酯酵母总酯含量的影响

图3　发酵温度对酵母Y2产酯力的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on ester-producing ability of yeast Y2

由图3可知，发酵温度在一定范围内，酵母的总酯含量先升高再降低。当发酵温度为26～28℃时，酵母的总酯含量随温度增高而增加；当发酵温度为28℃时，酵母的总酯含量达到最高，测定得总酯含量为1.12 g/L；当发酵温度＞28℃之后，酵母的总酯含量有所下降。可能是一方面当发酵温度升高时，微生物体内的生化反应和产酶速率都有所提升，所以总酯含量会有一定的提升；而另一方面，温度超过微生物最适宜生长的范围，则会使微生物体内的蛋白质变性，导致微生物生长和发酵产酯都受到影响，从而总酯含量下降。因此，选择28℃为最佳的发酵温度。

2.1.4发酵时间对酯化酵母总酯含量的影响

图4　发酵时间对酵母Y2产酯力的影响Fig.4 The effect of fermentation time on ester-producing ability of yeast Y2

由图4可知，发酵时间在1～5 d时，酵母总酯含量也随之增加。当发酵培养时间到达4 d时，酵母总酯含量达到相对最高，测定得总酯含量为1.21 g/L；发酵时间＞4 d之后，酵母总酯含量虽然有所增加，但极其平缓。可能随着发酵时间的增加，产酯酵母快速的生长繁殖并大量的分泌酯化酶，当发酵培养到4 d左右时，生长最为旺盛，酵母总酯含量也相对最高，随后继续发酵培养，随着营养物质的消耗殆尽，菌株生长减缓甚至凋亡，故基本丧失总酯含量。因此，发酵时间4 d较为适宜。

2.2产酯发酵条件优化的正交试验

根据单因素试验结果，选择菌种接种量（A）、培养基初始pH（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4个因素，以产酯酵母总酯含量为考察指标，进行4因素3水平L9（34）正交试验，试验结果见表2，方差分析见表3。

表2　产酯发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for esterproducing fermentation conditions optimization

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，4个因素对产酯酵母总酯含量的影响由大到小依次为培养基初始pH＞发酵温度＞发酵时间＞菌种接种量。由极差分析结果表明，酵母接种量、培养基初始pH、发酵温度、发酵时间最优的水平组合为A2B2C3D2，即菌种添加量为4%、培养基初始pH为5、发酵温度为30℃、发酵时间为4 d。在此最佳发酵条件下，总酯含量为1.24 g/L。由表3可知，各因素对酯化酵母总酯含量的影响均不显著（P＞0.05）。

3　结论

产酯酵母不仅能卓有成效的提高出酒率，且其分泌的酯化酶能促进酯化反应，使酒体协调，进而突出了清香型白酒乙酸乙酯的主体香味，提高清香型白酒的品质。以酯化酵母的总酯含量为考察指标，采用单因素试验及正交试验得到最佳发酵条件为接种量4%、培养基初始pH值为5、发酵温度30℃、发酵时间4 d。在此最佳条件下，产酯酵母Y2具有最高的总酯含量1.24 g/L。

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Optimization of fermentation conditions for producing ester of extracellular enzyme of yeast

WANG Pan，WEI Chengfeng，CAI Fengjiao，WANG Jiangbo*
（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation，College of Biological Engineering and Food Science，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

With the yeast Y2 from the Guanyintu koji as the research object，the extracellular enzyme fermented by strain Y2 fermentation medium was applied in esterification reaction system for catalytic reaction.Using the ester-producing ability as evaluation index，the ester-producing fermentation conditions of the strain Y2 were optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that in the conditions of yeast inoculum 4%，medium initial pH 5，fermentation temperature 30℃and time 4 d，the strain Y2 had the highest ester-producing ability（1.24 g/L）.

yeast；extracellular enzyme；ester-producing fermentation conditions；optimization

TS261

0254-5071（2016）09-0055-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.013

2016-04-30

湖北省科技支撑计划（2013BBA010）

王攀（1992-），男，本科生，研究方向为发酵工程。

汪江波（1962-），男，副教授，本科，研究方向为酿造及酒体设计。